172178. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vacina előállítására a Marek-féle betegség ellen
3 172178 4 pesz típusú vírust, amely jó védelmet adott az MB ellen. Calneknek és munkatársainak sikerült (Calnek B. et al: Applied Microbiology 1970. 20: 723—726.) ezt a pulyka herpesz vírust sejtmentesen is kinyerni és liofilezni, ami a vakcina előállítását és tárolását lényegesen megkönnyíti (2 158 293 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat). A Marek-féle betegség elleni vakcinák védőhatása, mai ismereteink szerint, jórészt azon alapszik, hogy a szervezetbe bevitt vakcina törzs elszaporodik, majd tartósan magas titerben megmarad a szervezetben és így megakadályozza a virulens MB vírus nagymértékű elszaporodását és ennek következtében onkogén hatásának érvényesülését a vakcinázott állatban. A baromfi környezetében ugyanis az MB vírusának háromféle vijalenciájú változata' iordul elő: virulens, mérsékelt yirulenciájú és avirulens.'.Ezek az MB vírusok a vakciházott állat szervezetében meg tudnak telepedni, de ha «Kyakcina-vírus már kelőképpen elszaporodott és elég ^magás>-koncejUrációbán van jelen, akkor nem tudnak nagyobb mértékben elszaporodni és megbetegíteni az állatot. Az Amerikai Egyesült Államokban izolált FC126 jelű pulykaherpesz vírussal lényegesen sikerült ugyan az MB okozta veszteségeket csökkenteni, de az állományokban néhány %-os (1—5%-os) veszteség általában még így is előfordul, sőt esetenként ennél nagyobb is. Saját vizsgálataink szerint a világszerte használt FC126 törzs a naposcsibék szervezetében aránylag lassan és egyenetlenül szaporodik el. Kísérleteink során csirkékből izoláltunk élő, nempatogén, A-antigénnel rendelkező törzset, amely különböző szövettenyészetekben jól elszaporítható, és amely hatékony védelemmel ruházza fel a fertőzésnek kitett csirkéket. Ez az általunk izolált törzs, az Ml jelzésű törzs, lényegesen gyorsabban szaporodik el és magasabb titerben marad meg az állatok szervezetében. Az általunk izolált Ml jelzésű törzsnek az irodalomban Rispens által leírt törzstől eltérően az az előnye, hogy csirkeembrió szövetben is jól szaporodik, így ebből kellő töménységű sejtmentes vírus-szuszpenzió állítható elő, amely liofilizálható is. (A Rispens-féle avirulens MB vírus vakcinát ugyanis csak kacsaembrió szövettenyészetben tudják elszaporítani és ez nem liofilizálható.) A találmány értelmében úgy állítunk elő élő legyengítetlen M1 jelzésű tyúk-herpesz vírus törzset tartalmazó sejthez kötött fagyasztott vagy sejtmentes és kívánt esetben fagyasztott vagy liofilizált vírus vakcinát, hogy az Országos Közegészségügyi Intézetben az 1974. október 18-án 00 130 szám alatt letétbe helyezett tyúkherpesz vírus törzzsel csirkeveséből, csirkeembrió-fibroblasztból vagy kacsaembrió-fibroblasztból származó szövettenyészetet beoltunk, a beoltott tenyészetet inkubáljuk, majd a sejteket elkülönítjük az inkubált tenyészetből és friss tenyészetre helyezzük és így sorozatos sejttenyésztést végzünk, majd a) élő, legyengítetten sejthez kötött vírusvakcina előállítása esetén az utolsó sejttenyészetben a sejteket tripszinnel kezeljük, majd a sejteket elválasztjuk a tripszintől és dimetilszulfoxidot vagy glicerint tartalmazó tenyésztési közegben szuszpendáljuk és fagyasztjuk, vagy b) élő, legyengítetlen, sejtmentes vírusvakcina előállítása esetén az utolsó sejt tenyészetben .a sejteket tripszinnel kezeljük, ezután a sejteket a tripszintől elválasztjuk, elroncsoljuk, az elroncsolt sejteket eltávolít2 juk, majd kívánt esetben a kapott vakcinát fagyasztjuk vagy fagyasztva szárítjuk. A fenti módon előállított vakcinával oltott, az MB iránt genetikailag nagyon fogékony csirkék nem betegedtek meg. A vakcinával oltott naposcsibék a vadvírus megbetegítő képességével szemben ellenállónak bizonyultak. A találmány szerinti eljárást az alábbiakban részletesen ismertetjük. A Phasenidae herpesz vírus 2-t, az Ml izolátumot egy SPF csirkeállományból izoláltuk az állatok véréből és veseszövetéből. Az izolátum mind szerológiailag, mind virológiailag azonosnak bizonyult a Marek-féle betegség herpesz vírusának (MBHV) különféle izolátumaival, de genetikailag nagyon fogékony csirkékben sem klinikai, sem kórbonctani elváltozást nem okozott az izolá<tum magas dózisa. Az izolátumokat vérsejt, illetve vesesejt szuszpenzióból indítottuk. A közvetlen vesetenyésztési mód esetében a vesesejteket tripszint és etilén diamin tetraecetsav-dinátriumsót is tartalmazó fiziológiás sóoldattal diszpergáltuk, majd ismételt mosás után tenyésztő edényekbe mértük. A vérsejteket és az előbb említett módon nyert vesesejt szuszpenziót többször mostuk fiziológiás sóoldatban, majd 4—24 órás esirkevese (CSVH), csirkeembrió fibroblaszt (CSEF), vagy kacsaembrió fibroblaszt (KEF) szövettenyészetekhez adtuk. A tenyészeteket 37 °C-on 5% C02-t tartalmazó légtérben magas páratartalom mellett inkubáltuk, és szükség szerint cseréltük a tápfolyadékot. A tenyészetekből a vírussal fertőzött sejteket a tripszin és etiléndiamintetraecetsavdinátriumsó fent említett fiziológiás konyhasóoldatával nyertük ki, majd friss tenyészeteket fertőztünk velük. Az egymást követő átoltásokat mindaddig végeztük, amíg elég vírust tartalmazó sejtet kaptunk. Rendszerint 4—7 passzázs szükséges ahhoz, hogy a kellő mennyiségű vírust előállítsuk. 1—1 termelés anyagát, amely 106—3X106 PFE/ml fertőző dózist tartalmaz, általában 1—2 X107 sejt/ml dózisban osztjuk szét. A sejthez kötött vakcinát dozírozás után azonnal hűtjük, és — 70 vagy —196 °C- on tároljuk felhasználásig. Eljárhattunk úgy is, hogy a fent beállított titerű, sejthez kötött vakcinát sejtmentessé tesszük és liofilizálás után előnyösen — 20 °C-on tároljuk. A vakcinák sejtmentessé tehetők, ha a sejteket valamilyen módon szétroncsoljuk; a leggyorsabb .eljárás az ultrahang kezelés. Az így sejtmentessé tett vakcinái vagy mélyhűtve tároljuk, vagy liofilizájjuk és előnyösen — 20 °C-on tároljuk. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük. 1. példa 4 hetes specifikus kórokozótól mentes.(SPF) leukózistól mentes csirkék veséjét sterilen eltávolítjuk. Ezután steril körülmények közt a veséket borsónyi darabokra vagdossuk, majd 0,1% tripszint és 0,02% EDTAidinátriumsót tartalmazó fiziológiás sóoldatban 37 °Cion emésztjük a veseszövet .darabkákat. Az emésztőnedvek jobb hozzáférhetősége céljából .a szuszpenziót mágneses keverővei .keverjük. A szövet darabkákról leváló egyed* sejteket a .durvább darabkáktól különválasztjuk. Utóbbiak emésztését .a leírt módon folytatjuk. JEzt.az,eljárást több ízben megismételjük. Az első emésztési frakciót 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
