172077. lajstromszámú szabadalom • Eljárás félszintetikus 7-amino-cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására enzimes hidrolizissel és szintézissel

3 172077 4 b) a kapott 7-amino-vegyület kémiai acilezése a végtermék előállítása céljából. így két egymást követő lépés ugyanazon enzimmel, vagy sejttömeggel végezhető, a 7-amino-vegyület izolálása nélkül. 5 A találmány szerint úgy járunk el, hogy a) valamely, a G-penicillin gyűrűjének kémiai kibővítéséből, I általános képletű 7-acilamino-cef-3--em-4-karbonsav-származékot, melyben R jelentése olyan III általános képletű csoport, amelyben X' és 10 X" hidrogénatomot jelent és R( a fentiekben megadott, foszfátpufferben Escherichia coli ATCC 9637 baktériumsejtekkel, vagy abból kivont és tisztított penicülinacilázzal kezelünk, és a keletkezett I általános képletű 7-amino-cef-3-em-4-karbon- 15 savszármazékot, melyben R hidrogénatomot jelent és Rj a fent megadott, kívánt esetben valamely II általános képletű acilezőszer - ahol R2 1-4 szénatomos alkoxicsoportot jelent és X' és X" a fent megadott - feleslegének jelenlétében foszfát- 20 pufferben Escherichia coli ATCC 9637 baktériumsejtekkel vagy azokból kivont és tisztított penicülinacilázzal kezeljük, vagy b) olyan I általános képletű vegyületek 25 előállítására, amelyekben R jelentése III általános képletű csoport, egy olyan (I) általános képletű vegyületet, melyben R hidrogénatomot jelent és RÍ a fent megadott, valamely II általános képletű acilezőszer - ahol R2 1-4 szénatomos alkoxicso- 30 portot jelent és X' és X" a fent megadott -feleslegének jelenlétében foszfátpufferben Escherichia coli ATCC 9637 baktériumsejtekkel vagy azokból kivont és tisztított penicülinacilázzal kezelünk. 35 Az I általános képletű vegyületek előállítását részletesen ismerteti Flynn: Cephalosporins and Penicillins (1972, Academic Press) című munkája. Mind a sejtekkel, mind az enzimes kivonatokkal 40 a hidrolízist pH 6,0-9,0, előnyösen pH 8-8,5 között hajtjuk végre. A hőmérséklettartomány. 0-50 C°, előnyösen 37 C°. A szintézist azonos sejtekkel vagy enzimes kivonatokkal hajtjuk végre, mint a hidrolízist, de a pH-t 3,0-8,0-ra, előnyösen 45 7,0-ra csökkentjük. A szintézist a reakció egyensúlyának eltolása céljából az acilezőszer moláris feleslegének jelenlétében kell végrehajtani, az acilezőszer és a 50 cefalosporánsav mólaránya 1-5, előnyösen 2,5. Mivel az enzim katalizálja az acilezőszer észtervagy amidcsoportjának, valamint a termék amidkötésének hidrolízisét, a maximális koncentráció elérése után célszerű a reakciót gyorsan leállítani. 55 Ez úgy valósítható meg, hogy - sejtek használata esetén - a sejteket centrifugálással eltávolítjuk a reakcióközegből, vagy - enzimes kivonat használata esetén - a pH-t körülbelül 2,0-ra csökkentjük. 60 A következő példák a találmány bemutatására szolgálnak, oltalmi körének korlátozása nélkül. A II általános képletű vegyületeket például a T/l 1 168 számú közzétett magyar szabadalmi bejelentés ismerteti. 65 1. példa Escherichia coli ATCC 9637 baktériumokat süllyesztett aerob kultúrában tenyésztünk. A tápközeg összetétele g/literben kifejezve a következő: húskivonat 10 pepton 10 nátrium-klorid 5 fenil-ecetsav 2 A pH-t 7,0-ra állítjuk be, és a hőmérsékletet 24 C°-on tartjuk. A fermentációt 20 óra múlva leállítjuk. A tenyészet 1 litere átlagosan olyan mennyiségű E. coli biomasszát tartalmaz, amely 1 óra alatt, 37 C°-on, pH 7,8-nál 40 mM G-penicülin-káliumot képes hidrolizálni (40 000 E). 2 liter tenyészetből centrifugálással elválasztott és pH 7,8-as kálium-foszfát-pufferrel mosott biomasszát (80 000 E) keverés közben, 37 C°-on 0,1 M kálium-foszfát-pufferrel készül 0,5 liter 6%-os (súly/térfogat) 7-(2'-fenilacetamido)-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav-oldattal (90 mM) reagáltatunk. A pH-t nátrium-hidroxid folyamatos adagolásával állandó szinten tartjuk. 2,5 óra múlva - sztöchiometrikus mennyiségű nátrium-hidroxid elfogyása után - a reakcióelegyet lecentrifugáljuk, és a felülúszót - körülbelül 4 C°-ra lehűtve - 200 ml n-butil-acetáttal és annyi 6 n sósavval kezeljük, hogy pH-ja 2,0 legyen. Az elvált vizes fázis pH-ját 5 n nátrium-hidroxiddal 4,6-ra állítjuk be, és azonos térfogatú etil-alkoholt adunk hozzá. A kapott csapadékot elválasztjuk, víz/alkohol 1 : 1 eleggyel mossuk és szárítjuk. 18,7 g (87 mM) 7-amino-3-metü-cef-3-em-4-karbonsavat kapunk, 95% tisztaságban. 2. példa Escherichia coli ATCC 9637 törzset az 1. példa szerint fermentálunk. 3 liter tenyészetből kapott biomasszát 0,01 M trisz-HCl pufferben (pH = 8,5) szuszpendálunk és Manton-Gaulin típusú homogenizátorral homogenizáljuk (2 ciklus, 700kg/cm2). Ezután annyi hexadecü-piridinium-kloridot adunk hozzá, hogy ennek végkoncentrációja az elegyben 0,4% legyen, és a pH-t 4,5-re állítjuk be. A hőmérsékletet 37 C°-on tartjuk. 3 óra múlva az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk. A tiszta felülúszóból penicülin-acilázt vonunk ki ammónium-szulfátos (65%-os telítés) kicsapással. A kapott csapadékot 0,1 M foszfát-pufferben (pH = 7,8) szuszpendáljuk és ugyanezen puffer 20 térfogatával szemben dializáljuk. A dializált termékhez (500 ml) 30 g (90 mM) 7-(2'-fenü-acetamido)-3-metü-cef-3-em-4-karbonsavat adunk. A pH-t 7,8-ra állítjuk be és folyamatos nátrium-hidroxid-adagolás útján ezen az állandó szinten tartjuk. 2,5 óra múlva, amikor a hidrolízis befejeződött, a reakcióelegyből az 1. példában leírtak szerint 18,1 g 7-amino-3-rnetü-cef-3-em-4-karbonsavat nyerünk ki (93% átalakulás). 2