172074. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimes reakciók végrehajtására kétfázisú vizes-szerves rendszerek alkalmazására
7 172074 8 22 óra 46 óra 72 óra Az izomer pH Átalakulási % szteroid 3 óra 45 perc után foltjainak jelenléte 6,8 7,3 7,5 8,8 14 18 20 30 50 58 62 70 84 90 92 96 93 95 100 100 igen igen igen nincs 4. példa Különböző mennyiségű lipázt (Koch-Light kat. 1503L) oldunk 5 ml nátriummalát pufferben (0,1 M), pH = 6,5. Az első esetben 5 ml enzimoldatot összerázunk 2,5 ml diklóretánban oldott 2,5 ml olivaolajjal és 37 C°-on, keverés közben egy óráig inkubáljuk. A második esetben 5 ml enzimoldatot összerázunk 2,5 ml olivaolajjal és 37 C°-on, keverés közben egy óráig inkubáljuk. Ennek az időnek eltelte után 30 ml aceton-etanol (összetétel 15:15) elegyet adunk hozzájuk az emulzió megtörése céljából, és az enzimes katalízis következtében szabaddá vált zsírsavakat 0,05 M nátriumkarbonáttal megtitráljuk. A vizsgálati adatokat alább közöljük: 20 szemikarbazid-HCl 12,5 mg glicin 16,7 mg redukált glutation 3 mg NAD 30 mg Az elegyet inkubáljuk. 25 Mérés oldószerrel Mérés emulzió nélkül oldószer nélkül Lipáz mg Mmól zsírsav egy óra után 37 C°-on 14,4 97 — 28,8 206 -43,2 310 280 57,6 439 400 5. példa Alkohol-dehidrogenáz Enzimforrás: élesztőből (Bachringer 15418 FAAD) Reakció: Butanol + NAD+ -» butánaldehid + NADH + H+ 1. Vizsgálat: butanoUal, oldószer nélkül A reakcióelegy 10 ml pirofoszfátpufférből áll (0,1 M), pH = 9, amelyben a következő anyagok vannak oldva: keverés közben 5 ml butanoUal 2. Vizsgálat: benzollal kevert butanoUal Az 1. vizsgálatnál leírt elegyet 5 ml butanol és 5 ml benzol elegyével inkubáljuk keverés közben, 20 C°-on. 30 Vizsgálati adatok: Optikai sűrűség 340 nm-nél 35 Idő (perc) 1. vizsgálat 2. vizsgálat 40 45 50 55 0 0,190 0,190 5 3,85 3,80 10 4,95 5,30 30 7,65 9,60 60 9,4 12,60 145 10,3 15,0 180 11,4 16,3 300 11,7 17,5 1320 12,2 20,4 Ha csak egyedül butanol van jelen, az enzim inaktiválódik, ami megmagyarázza azt a tényt, hogy az 1. vizsgálatban a reakció 5 óra után nem halad előre számottevő mértékben. A 2. vizsgálat reakciókörülményei között a gázkromatográfiás analízis azt mutatja, hogy a vizes fázisban az n-butanol koncentrációja a kevéssé előnyös megoszlási koefficiens következtében 3%, vagyis alacsonyabb, mint amikor az aromás oldószer nincs jelen. 60 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás szteroidoxidációs, valamint lipázzal és dehidrogénező enzimekkel vizes-szerves közegben enzimreakciók végrehajtására, melyek során a szubsztrát nem oldódik az enzimet tartalmazó vizes 65 közegben, azzal jeUemezve, hogy a reakciót 4
