172074. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimes reakciók végrehajtására kétfázisú vizes-szerves rendszerek alkalmazására
3 172074 4 Vízoldhatatlan szubsztrátok enzimes átalakítását jó kitermeléssel végrehajthatjuk vizes-szerves kétfázisú rendszerekben, ahol a szerves oldószer (vízzel nem elegyedő) jó oldószere a szubsztrátnak, az enzim pedig természetes vizes közegben működik, ily módon az oldószer közvetlen denaturáló hatását megelőzzük. A szerves oldószer szerepe nemcsak az, hogy a szolubizálja a szubsztrátot, hanem, hogy biztosítsa a vizes fázisban a konstans koncentrációt (gyakorlatilag ez telítettséggel egyenlő vízben alig oldódó anyagok esetében), amely mellett az enzimes átalakulás végbemegy. Ehhez a „rezervoár" szerephez adódik még egy másik, amely nagyon fontos a reakciósebesség szempontjából, ez pedig a reakciótermékek folyamatos kivonása a vizes fázisból a nem elegyedő szerves oldószer segítségével. Ez azokban az esetekben igaz, amikor az oldhatatlan szubsztrátok enzimes átalakulási termékeinek megoszlási koefficiense még kedvező a szerves fázisra nézve. A reakciótermékek ilyen kivonása nem érhető el, például a szubsztrát emulgeálásával, ez előnyös és egyedülálló tulajdonsága a találmány szerinti eljárásnak. A végtermékek kivonása nagy fontosságú bizonyos esetekben, hatása nemcsak az, hogy eltolja a reakcióegyenletet, hanem mindenekelőtt, hatásos ott is, ahol a reakciótermékek koncentrációjának megnövekedése a vizes fázisban gátló hatású az enzim katalitikus aktivitására. A találmány szerinti eljárást olyan enzimes reakciók esetében alkalmazzuk, ahol a szubsztrát vízoldhatatlan, vagy vízben alig oldódó. A találmány szerinti alkalmazási terület a szteroidok oxidációja, valamint a lipázzal végzett hidrolízis és dehidrogénezések. Az alkalmazható szerves oldószerek: 2-8 szénatomos alifás karbonsavak észterei, például az etil- vagy butilacetát, 2—8 szénatomos alkiléterek, például dietiléter, 4—8 szénatomos alkoholok, például a butanol vagy adott esetben halogénezett 2-8 szénatomos alifás vagy aromás szénhidrogének, például a benzol, diklóretán vagy triklóretilén. 1. példa Lakkáz Enzimforrás: Taplógomba folyadéktenyészetéből származó tisztított enzim. Reakció: lakkáz Szubsztrát + 02 ->• a szubsztrát oxidációs terméke + 02 Aktivitási vizsgálat Típusvizsgálatban, 10 mg/ml ösztradiolt (3,6xlO"2 M) tartalmazó 5 ml etilacetátot egyenlő térfogatú acetátpufferrel emulgeálunk (0,1 M, pH = 5,4 érték), amely 0,060 mg/ml (10-6 M) lakkázt tartalmaz. Az elegyet 25C°-on inkubáljuk keverés közben a gázfázisban, tiszta oxigén vagy levegő jelenlétében. Különböző időkben 5 ml 5 szerves fázist elveszünk a reakcióelegyből az ösztradiol és a lehetséges termékek analízise céljából. 10 Eredmények 4 óra után, a fent leírt reakciókörülmények között az ösztradiol 50%-a termékekké alakul át (legalább 5 vegyületté), amelyek kromatográfiával 15 elkülöníthetők. Szerves fázis nélkül elvégezve a vizsgálatot, a lakkázt tartalmazó acetátpuffert ösztradiollal telítve, közönséges módszerekkel nem tudtuk kimutatni, a reakció végbemenését. Ez talán a vizes fázisban elérhető túl alacsony szteroidkon-20 centráció miatt következik be. A vizsgált szubsztrátok Az ösztradiolnál megfigyelt sebességgel (t1/2 = 25 4 óra) a jelzett reakciókörülmények között, a következő szubsztrátok átalakulása ment végbe: Ösztradiol, ösztron, ösztriol, ekvilin, ekvilenin, dietilstilbösztrol. 30 Az etilacetátot egyéb szerves oldószerekkel helyettesítettük hasonló eredménnyel, (42-51%) így például triklóretilénnel, dietiléterrel, etiléndikloriddal. 2. példa Hidroxiszteroid-dehidrogenáz (HSDH) 40 Enzimforrás Pseudomonas testosteroni sejtekből (Sigma H 9004): gyártja a Sigma Chemical Co., St. Louis, AEA. Reakció Tesztoszteron + NAD+ HASDH 4 - androsztén-50 3,17 -dión + NADH + H" HSDH = hidroxiszteroid-dehidrogenáz NAD = nikotinamid-adenin-dinukleotid Vizsgálati körülmények: 2,5 mg NAD+ -ot és 0,05 HSDH egységet tartalmazó 3,2 ml foszfátpuffert, 0,2ju pH = 7,6 60 értéknél, 13mg tesztoszteront tartalmazó, (1,4 x IGT 2 M) (3,2 ml szerves oldószerrel emulgeálunk 22C°-on. Az elegyet kevertetjük (100 fordulat/perc) és különböző időintervallumokban meghatározzuk a vizes fázis optikai sűrűségét 65 340 nm-nél.
