171986. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sztreptokokkusz-anyagcseretermékek, különösen sztreptokináz, sztreptodornáz, sztreptolinizin 0 és hialuronátliáz kinyerésére

171986 majd a kapott oldatot azonos pufferrel szemben szulfátionmentesre dializáljuk. Az oldatot ezután felvisszük egy 2,5 cm x 25 cm méretű oszlopra, amely olyan térhálósított agarózból készült, amelyhez dietilaminoetilcsoportok kapcsolódnak. A gyantát a Pharmazia svéd cég Sepharose 6 B márkanevű gyantájának vagy gyöngyformájú 6%-os agaróz-gélnek Porath és munkatársai módszerével [I. Chromatography, 60, 167 (1971)] végzett térhálósítása, majd ezt követően Peterson és Sober módszerével [Biochem. Preparations, 8, 39 (1961)] 2-klór-trietilaminnal végzett kezelése útján állítjuk elő. Ezt az úgynevezett DEAE-agaróz-Q gyantát előzetesen az oszlopon 1 liter 0,5 n nátrium-hidroxid-oldattal és vízzel végzett mosás, valamint 0,02 mólos foszfátpufferrel (pH-ja 8,0) végzett ekvilibrálás útján előkészítjük. Ezután lineáris gradiens eluálást végzünk 1 liter 0,02 mólos foszfátpufferrel (pH-ja 8,0) és 1 liter 0,02 mólos, 0,4 mól nátrium-kloridot tartalmazó foszfátpufferrel (pH-ja 7,6). Mintegy 0,0 mól nátrium-kloridnál eluálódik a sztreptolizin, 0,05 mól nátrium-kloridnál a hialuronátliáz, 0,10 mól nátrium-kloridnál a sztreptokináz és 0,2 mól nátrium-kloridnál a sztreptodornáz. Az aktív frakciókat összeöntjük. Az egyesített frakciók kísérleti célokra kielégítően tiszták. Minden műveletet szobahőmérsékleten, a kromatografálást pedig 4 C°-on végezzük. A kromatografálás után a sztreptokináznál az eredeti aktivitás 60%-a, a sztreptodornáznál 25%-a a hialuronátliáznál 20%-a és a sztreptolizin 0-nál 15%-a észlelhető. Abszolút mennyiségek: sztreptolizin 0 = 96 000 HU, hialuronátliáz = 100 000 TE, sztreptokináz = 12 600 000 Christensen-egység és sztreptodornáz = 625 0Q0 viszkozimetrikus egység. 2. példa Az 1. példában ismertetett módon 5 liter ott említett Streptococcus-tenyészetet feldolgozunk és a sejteket 3,5-es pH-n 1 órán végzett keverés útján elöljük. Az elölt Streptococcus-sejtekből az anyagcseretermékek 1. példában ismertetett módon végzett eluálása után 500 ml oldatot kapunk 0,1 mólos foszfátpufferben. Ezt az oldatot 15 g nagy diszperzitásfokú szilícium-dioxiddal (éspedig a Chemiekombinat Bitterfeld NDK-beli cég Silipur márkanevő termékével) 2 órán át szobahőmrésékleten keverjük. így a sztreptolizin O, sztreptodornáz és a sztreptokináz adszorbeálódik, míg a hialuronátliáz oldatban marad. Az utóbbi anyagcsereterméket 300 g ammónium-szulfáttal végzett kicsapás után az alábbiakban ismertetett módon tisztítjuk. A kapott csapadékos elegyet egy éjszakán át állni hagyjuk, majd a csapadékot centrifugálás útján elkülönítjük. A csapadékot ezután 10 ml vízben feloldjuk, majd az oldatot tisztára centrifugáljuk. Az oldatot ezután 0,02 mólos foszfátpufferrel szemben dializáljuk, majd az 1. példában'ismertetett módon 2,5 cm x 25 cm méretű DEAE-agaróz-Q oszlopra visszük fel és az ugyanebben a példában ismertetett módon kromatografáljuk. (így a fermentleben levő mennyiségre vonatkoztatva közel 15%-os hozammal közel 1200TE/mg aktivitású hialuronátliázt kapunk. Abszolút mennyiség: 75 000 TE). A szilícium-dioxidhoz kötött komponensek, így a sztreptolizin, sztreptodornáz vagy a sztreptokináz pH 9,5 és 10,5 közé, előnyösen 5 10,0 pH-értékre beállított vízzel végzett 20 perces keverés útján újra deszorbeálhatók illetve oldatba vihetők. Ezek az anyagcseretermékek ezután a még ismertetendő 4. példa szerint továbbtisztíthatók. 10 3. példa A többi anyagcsereterméktől a hialuronátliáz már a nyers szűrt fermentléből elkülöníthető szilí-15 cium-dioxiddal végzett kezelés útján. 5 liter centrifugált fermentlét pH 7,5 értéken 15 g nagy diszperzitásfokú szilícium-dioxiddal (a 2. példában említett Silipur márkanevű termékkel) keverünk 2 órán át. A szilícium-dioxidon adszorbeálódott kom-20 ponensek, így a sztreptolizin, sztreptodornáz vagy a sztreptokináz a még ismertetendő 4. példa szerint továbbtisztíthatók. (így 60 000-80 00 E/mg fajlagos aktivitású sztreptokináz és 10 000-20 000 E/mg fajlagos aktivitású sztrepto-25 dornáz állítható elő.) A hialuronátliáz ammónium-szulfáttal végzett kicsapás után a 2. példában ismertetett módon tisztítható. 30 4. példa Ebben a példában is olyan nyers koncentrátumból indulunk ki, amelyet 5 liter szűrt fermentléből 35 az elölt sejtek 250-250 ml 0,1 mólos foszfátpufferrel (ph-ja 8,0) kétszer végzett eluálása útján kaptunk. A 450 ml térfogatú, tisztára centrifugált oldat pH-értékét 3,5-re beállítjuk, majd a benne levő anyagokát 10 vegyes% nátrium-klorid (45 g 40 nátrium-klorid) adagolása útján kicsapjuk. 30 perces állás után a csapadékot centrifugálás útján elkülönítjük, majd 100 ml vízben 1 n nátrium-hidroxid-oldat cseppenkénti adagolása mellett feloldjuk. Az oldhatatlan maradékot eldobjuk. Ehhez az ol-45 dathoz ezután 10 ml 0,5 mólos dinátrium-hidrogén-foszfát-oldatot adunk, majd pH-értékét 6,9-re beállítjuk. Keverés és a pH-nak 1 n nátrium-hidroxid-oldat cseppenkénti adagolása útján történő stabilizálása mellett az oldatban levő anyagokat ezután 50 5,0 ml 1 mólos kalcium-klorid-oldat cseppenkénti adagolása útján kicsapjuk. A csapadékos elegyet ezután 15 percen át keverjük, majd újabb 45 perc elteltével a csapadékot centrifugálás útján elkülönítjük. A kalcium-foszfát csapadékot ezután 50 ml 55 0,02 mólos foszfátpufferrel (pH-ja 8,0) mossuk. Ebből a csapadékból a kötött sztreptolizin visszanyerése Pentz, E. J. és Shigemura G. módszerével [J. Bacteriol., 69 210 (1955)] végezhető. A centrifugálásnál kapott felülúszó fázist ezután a mosó-60 oldattal összeöntjük, majd az így kapott, 140 ml-nyi oldatot 38 ml telített ammónium-szulfát-oldattal 21,3%-os ammónium-szulfát telítettségre hozzuk. 15 percen át tartó keverés után az oldatot 45 percen át ülepedni hagyjuk, majd a kivált 65 csapadékot centrifugálás útján elkülönítjük. A csa-4