171962. lajstromszámú szabadalom • Eljárás laktát-dehidrogenáz izomerjeinek egyidejű vagy külön történő meghatározásáram és diagnosztikai eszköz a meghatározás elvégzésére

3 171962 4 nősen meglepő, hogy csak savas pH-nál végzett mérésnél határozható meg az LDH—4 és az LDH-5 teljes mennyiségében. így savas pH-tartományban végzett mérés esetében az LDH összes meghatározható izoenzimjeinek összmennyiségét optimalizálhatjuk, és lehetővé válik, hogy az LDH—4 és az LDH—5 izoenzimeket külön-külön vagy egymással alkotott keverékük formájában, de más LDH-izoenzimekkel együtt is meghatározzuk. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás az LDH—4 vagy LDH—5 izoenzim vagy ezek egymással vagy más LDH-izoenzimekkel alkotott keverékeinek meghatározására laktat és NAD+ piruváttá való reagáltatása útján. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a reagáltatást 6,0 és 6,5 közötti pH-értéken végezzük. Bár a reagáltatáshoz elégséges kis mennyiségű folyadék, a reagáltatást azonban célszerűen folyékony közegben hajtjuk végre. Megállapítottuk továbbá, hogy mintegy 6,3-6,4 pH-érték különösen alkalmas az LDH-4 és az LDH—5 egyidejű meghatározására, mely izoenzimek például a hüvelyváladékban észlelhetők, bizonyos megbetegedések esetében. Előnyösen a laktat és az NAD reagáltatásához alkalmazott közegben nagy pufferkapacitást biztosítunk. Ez azzal az előnnyel jár, hogy pH 6-tól erősen eltérő saját pH-jú testfolyadékok vizsgálatánál is a reagáltatáshoz, illetve meghatározáshoz szükséges optimális pH-érték tartható. A laktat és az NAD reagáltatását önmagában ismert módon közel 37 C°-on végezzük. A reagáltatáshoz a koenzimek mennyiségét úgy állítjuk be, hogy elegendők legyenek optimális mértékben a vizsgált folyadékban jelenlevő összes izoenzim meghatározásához. A későbbiekben még megadott adatokat figyelembe véve a koenzimek optimális mennyisége néhány rutinkísérlettel meghatározható. Az LDH meghatározása nagy jelentőségű különösen testfolyadékok vizsgálata esetében. Míg egészséges embereknél ezen izoenzimek túlnyomó része a szövetekben található, addig abnormális szövetnövekedés, fehérvérűség vagy más megbetegedések esetében az izoenzimek jelentős koncentrációban megjelennek a vérszérumban vagy más testnedvekben. Különösen megállapítható, hogy patologikus elváltozások esetében a női genitalis traktus alsó részében a hüvelyváladékban ezek az izoenzimek megjelennek. A találmány szerinti meghatározási módszer bármely testnedvre alkalmazható. A vizsgálandó minta pH-értékének beállítása a minta saját pH-értékétől függ. Minden esetben azonban biztosítani szükséges a reagáltatáshoz 6,3—6,4, különösen mintegy 6,3 pH-értéket. Ennek megfelelően a meghatározás véghezviteléhez az alkalmazott tesztkompozíció összetételét megfelelően be kell állítanunk. Míg tehát az eddigiekben alkalmazott meghatározásnál (lásd a korábban már idézett „Enzymatische Analyse" irodalmi helyet) pH-optimumként 8,3-8,9 tartományt írtak elő, a találmány értelmében ettől a pH-tartománytól tudatosan eltérünk. Az ismert módszereknél feltételezhetően azért írtak elő bázikus pH-tartományt, mert a * LDH laktat + NAD ^ piruvát + NADH + H* 5 reakció során a laktat konvertálódásával sztochiometrikus viszonyban egy proton képződik. Annak érdekében, hogy az LDH hatására jelentkező egyensúlyt jobbra eltolják, bázikus tartományban 10 dolgoztak. A találmány értelmében ezzel szemben például vérszérumban vagy vérplazmában végzett meghatározás esetében a vizsgálandó próbát trietanolamin és nátriumhidroxid alkotta pufferrel közel 15 6,3-6,4 pH-értékre pufferoljuk, és a kimutatáshoz alkalmazott tesztkompozíciót ugyanerre a pH-értékre állítjuk be. A hozzávetőleges meghatározásoknál 6,0 és 6,5 közötti pH-értéket állítunk be, majd úgy pufferolunk, hogy a meghatározásnál a 20 pH értéke 6,3-6,4-re álljon be. Szérumalbumin esetében önmagában ismert módon glutationt is adagolunk. Az LDH izoenzimjeit optimálisan pH 6,3-6,4 értéken lehet meghatározni, ha gondoskodunk 25 arról, hogy a LDH laktat + NAD+ ^ piruvát + NADH + H* reakció egyensúlyát e reakciót követő reakciókkal 30 jobbra toljuk. E célból a reakcióelegyhez fenazinmetoszulfátot adagolunk, amely az NADH koenzimet állandóan oxidálja. A pH 6,0 és 6,5 között végzett mérés először teszi egyáltalán lehetővé az LDH—5 izoenzim teljes mennyiségben történő meg-35 határozását. Ennek azért van különös jelentősége, mert az LDH—5 izoenzim jelenléte rákos megbetegedések jele, és így lehetőség nyílik rák korai felismeréséhez exakt és érzékeny módszer kidolgozására. 40 Bizonyos testnedvek esetében azonban a fentiekben ismertetett viszonyok mások, minthogy ezeknek a testnedveknek az optimális 6,3-6,4 pH-értéktől eltérő saját pH-értékük van. Ilyen testnedv a hüvelyváladék, amelynek pH-értéke kö-45 zel 4. A hüvelyváladék esetében tehát az alkalmazott tesztkompozíciónak biztosítani kell az optimális pH-értéket a végbemenő reakcióhoz, ami annyit jelent, hogy a tesztkompozíció pH-jának magasabbnak kell lennie és ez a pH azután a 50 hüvelyváladékkal való keveredés hatására 6—6,5 pH közötti értékre csökken. így a találmány szerinti eljárásban olyan tesztkompozíciót alkalmazunk, amely laktátból, nikotin-55 amid-ademn-dinukleotidból (NAD) és az enzimatikus NAD-reakció láthatóvá tételére egy tetrazóliumsóból áll és amely olyan pH-értékre van pufferolva, hogy a vizsgálandó testnedvben végrehajtott tulajdonképpeni reakciónál 6,0 és 6,5 közötti 60 pH-érték, előnyösen, 6,3-6,4 álljon be olyan pufferekre, mint például a trietanolamin-nátriumhidroxid puffer vagy más savas, de foszfátpufferektől eltérő puffer. Száraz készítmény, vagyis száraz tesztkompozíció esetében ennek az említett pH-nak 65 a tesztkompozíció feloldódása után kell beállnia. 2