171838. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(alfa-fenil-alfa-amino)- acetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav észterek előállítására

5 171838 6 musok enzimreakciójával végzett gyártásához általában először a mikroorganizmust tenyésztjük, majd a kapott tenyészet vagy a tenyészet feldolgozása útján kapott anyag — amely természetesen tartalmazza a célvegyületeket szintetizálni képes enzimet — jelenlétében megfelelő körülmények között reagáltatjuk a kiindulási anyagként használt 2-fenil-glicin-alkilésztert és a III általános képletű 7-amino-cef-3-em-4-karbonsav-észtert. A fentiekben említett tenyészet előállítása történhet aerób kevertetett tenyészetben, rázott tenyészetben vagy nyugvó tenyészetben, és általában kívánatos a mikroorganizmus aerób körülmények közötti tenyésztése. A táptalaj összetételét illetően megjegyezzük, hogy a táptalaj az e célra ismert tápanyagok közül egy vagy több tápanyagot, így például húskivonatot, élszetőkw> natot, peptont, savas kazein-származékot vagy kukoricalekvárt, továbbá kívánt esetben még széntartalmú vegyületeket (így például cukrokat, szerves savakat, vagy n-paraffinokat), különböző szerves és szervetlen nitrogéntartalmú anyagokat (így például ammónium- vagy nitrátsók formájában kötött nitrogént), foszfátokat, magnéziumsókat, nátrium-kloridot, más fémionokat és különböző vitaminokat tartalmazhat. A táptalaj pH-értékét mintegy pH 6 és mintegy pH 8 közé állítjuk be. Az inkubálás hőmérsékletét előnyösen 20 CC és 40 °C, különösen előnyösen 24 °C és 37 °C között választjuk meg. Minthogy az inkubálás ideje a használt mikroorganizmus adott törzsétől és a tenyésztési körülményektől, közelebbről a tenyésztéshez alkalmazott berendezéstől, a táptalaj összetételétől és az inkubálási hőmérséklettől függ, a tenyésztést célszerűen akkor fejezzük be, amikor a használt mikroorganizmus aktivitása maximális, azaz a logaritmikus növekedési időszak utolsó időszaka és a stacioner növekedési szakasz kezdeti időszaka közötti időszakon belül valahol. Általában a tenyésztési idő mintegy 8 óra és mintegy 60 óra között változik. Az így kapott tenyészetet, vagy a tenyészet feldolgozása útján kapott anyagot használjuk az I általános képletű vegyületek előállítására szolgáló reakcióban. A „tenyészet feldolgozása útján kapott anyag" kifejezésen olyan, enzimet tartalmazó anyagot értünk, amely a tenyészetből bármely úton előállítható és az I általános képletű vegyületek előállításában hatásos. így például ha a fentiekben említett hatás intracelluláris (sejten belüli) jellegű, akkor a „tenyészet feldolgozása útján kapott anyag" kifejezés alatt bármely, enzimet tartalmazó anyagot értünk, amelyet vagy 1. a tenyészetből a sejtek elkülönítése és mosása, vagy 2. a tenyészetből ismert módon elkülönített, sejtmentes extraktum előállítása, vagy 3. a sejtmentes extraktumból a részben vagy teljesen tisztított, hatásos enzim ismert módon végzett elkülönítése, vagy 4. az elkülönített hatásos, részben vagy teljesen tisztított enzimnek kémiai vagy fizikai úton valamilyen vízben nem oldódó, nagy molekulasúlyú anyaghoz való kötése útján kaptunk. Ha a fentiekben említett hatás extracelluláris (sejten kívüli) jellegű, akkor a „tenyészet feldolgozása útján kapott anyag" kifejezésen értjük a hatásos enzimet tartalmazó, 1. a tenyészetből a sejtek elkülönítése útján kapott felülúszó folyadékfázist, vagy 2. ebből a folyadékfázisból enzimek tisztítására ismert módszerrel kapott, részben vagy teljesen tisztított, hatásos enzimet, vagy 3. ennek az enzimnek fizikai vagy kémiai úton valamilyen vízben nem oldódó, nagymolekulasúlyú anyaghoz való kötése útján kapott anyagot. A 2-fenil-glicin valamelyik rövidszénláncú alkilészteréből és valamely III általános képletű 7-amino-cefem-4-karbonsav-észterből kiinduló, a fentiekben ismertetett módon előállított tenyészet, vagy a tenyészet feldolgozása útján kapott anyag jelenlétében valamely I általános képletű vegyület előállítására irányuló eljárásban a kondenzációs reakciót általában előnyösen vizes közegben foganatosítjuk. A reakcióelegy pH-értékét előnyösen pH 4 és pH 8, különösen előnyösen pH 5 és pH 7 közé állítjuk be. Ha a tenyészet vagy a tenyészet feldolgozása útján kapott enzimtartalmú anyag vízoldható, akkor a kondenzációs reakciót oldatban foganatosítjuk. Másrészt viszont, ha a tenyészet vagy a tenyészet feldolgozása útján kapott enzimtartalmú anyag vízben nem oldódik, a kondenzációs reakciót vagy szuszpenzióban, vagy az alábbi módon foganatosítjuk: A 2-fenil-glicin valamelyik rövidszénláncú alkilészterét és valamely III általános képletű 7-amino-cefem-4-karbonsav-észtert tartalmazó vizes oldatot olyan kromatográfiás oszlopon bocsátjuk keresztül, amely oszlop meg van töltve a tenyészettel vagy a tenyészet feldolgozása útján kapott, enzimtartalmú anyaggal, amikoris a kondenzációs reakció aközben megy végbe, míg a vizes oldat az oszlopban lefelé folyik. A reakcióelegyhez ilyen esetben valamilyen, vízzel elegyedő szerves oldószert, így például valamilyen alkanolt vagy acetont adunk a kondenzációs reakció hozamának növelésére. A reakcióidő rendszerint 10 perc és 300 perc között változik, többek között a szubsztrátumok koncentrációja, az enzim aktivitása és a reakcióhőmérséklet értékétől függően. A reakcióhőmérsékletet 5 °C és 50 °C között választjuk meg. A szubsztrátum koncentrációját főleg az enzim aktivitásának értéke alapján választjuk meg; így például rendszerint a III általános képletű 7-amino-cefem-4-karbonsav-észtereket 0,1—10% koncentrációban használjuk. A III általános képletű 7-amino-cefem-4-karbonsav-észterekre mint kiindulási anyagokra vonatkoztatva az I általános képletű termékek hozamát úgy növelhetjük, hogy célszerűen a III általános képletű vegyületekre vonatkoztatva a 2-fenil-glicin valamelyik rövidszénláncú alkilészterét legalább egy mólekvivalensnyi mennyiségben, sőt — ha lehet — két vagy több mólekvivalensnyi mennyiségben használjuk. A fentiekben ismertetett tenyészet, vagy a tenyészet feldolgozása útján kapott enzimtartalmú anyag jelenlétében a 2-fenil-glicin valamelyik rövidszénláncú alkilészteréből és valamely III általános képletű 7-aminocefem-4-karbonsav-észterből előállított valamely I általános képletű 7-(a-fenil-a-amino)-acetamido-3-metil-cefem-4-karbonsav-észter a 2-fenil-glicint tartalmazó reakcióelegyből könnyen elkülöníthető például valami-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3