171615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új oktapeptidszármazékok előállítására
13 171615 14 ezután 0,52 ml (6 mmol) tributil-amint, majd 15 perc után -30C°-on 0,19 ml klórhangyasav-etilésztert adunk. A reakcióelegyhez 20-25 perc múlva az e) lépésben kapott vegyületből 1,5 g 10 ml tetrahidrofurános oldatát adjuk, amelyhez előzőleg 5 még 1 ml tributil-amint adtunk. A reakcióelegyet 1 órári át -20C°-on keverjük^ majd másnapig jégszekrényben állni hagyjuk. A semlegesre állított reakcióelegyet ezután bepároljuk, a visszamaradt anyagot vízzel, 5%-os citromsav-oldattal és telített 10 nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal eldörzsöljük, majd szárítjuk. Kitermelés: 1,5 g (60%). Rf 3 :0,4-0,5. g) Z-Asn-Arg(N02 )-Val-Tyr-Val-His- 15 -Pro-Phe(Cl)-OH (14. vegyület) 920 mg (0,73 mmól) nyers 13. vegyületet 10 ml metanolban szuszpendálunk, majd 2 ml In nát- 20 rium-hidroxid-oldat hozzáadása után 1 óra hosszat állni hagyjuk. A reakcióelegyet minimális térfogatra bepároljuk, majd jégecettel pH-ját 5-re állítjuk. A kivált anyagot szűrjük és vízzel, majd éterrel mossuk. 25 Kitermelés: 711 mg. A nyers terméket szilikagélen oszlopkromatográfiásan tisztítjuk. A nyers terméket piridin : ecetsav : víz = 20 : 6 :11 elegyében oldjuk, majd a ka- 30 pott oldathoz annyi etil-acetátot adunk, hogy az oldószerek aránya 60 : 20 : 6 :11 legyen. Az így kapott oldatot Kieselgel 60-oszlopra (átmérője 1,8 cm, magassága 80 cm) rétegezzük. Az eluálást piridin : ecetsav : víz : etilacetát = 20 : 6 : 11 : 60 35 eleggyel végezzük. A frakciókból vékonyrétegkromatogramot készítünk, és az Rf3,: 0,30-as frakciókat összeöntjük, majd bepároljuk. h) Asn- ^Va^PheíCl^-Angiotenzin (15. vegyület) 15 mg 14. vegyülethez 0,4 ml anizolt és 4,0 ml cseppfolyós hidrogén-fluoridot adunk 0C°-on. 1,5 óra reakcióidő után az anyagot éterrel kicsapjuk, az étert dekantáljuk, ezt többször megismételve a kapott terméket kiszűrjük és éterrel mossuk. Kitermelés: 270 mg 15. vegyület tri-hidrogénfluoridsó formájában. Rf2 :0,2. A sót ezután vízben oldjuk, az oldatot szűrjük, majd Amberlite IRA 400 (acetátformájú) gyantára visszük és közel 200 ml vízzel eluáljuk. Vákuumbepárlás után a maradékot éterrel eldörzsöljük, szűrjük, szárítjuk, majd vízben oldjuk és liofilizáljuk. Az anyag kromatográfiás és elektroforetikus vizsgálatok tanúsága szerint egységes. Kitermelés: 234 mg. WD=-54°±2(C = 0,5VÍZ). Rf i :0,5,R f 2 :0,2. Analízis: (molekulasúly: 1215,5): 5. példa (felhasználási példa) 1. vegyület előállítása A 15. vegyület acetátsójából 90 mg-ot 0,5 ml vízben oldunk és 0,15 ml trietil-amint adunk hozzá. Az oldatot 20 mg Pd/C katalizátort (10% fémtartalommal) tartalmazó 1,0 ml dimetilformamidhoz öntjük. A katalitikus hidrogénezés (közel 45 perc) után a katalizátort kiszűrjük, az oldószert pedig vákuumbepárlással eltávolítjuk. A maradékot karboximetil-cellulózt (gyártja Reanal) tartamú oszlopon tisztítjuk, 5,5 pH-jú ammónium-acetat pufferrel 0,01-0,1 mól gradienselúciót alkalmazva. A peptidet tartalmazó frakciókat egyesítjük és kétszer liofilizáljuk. így a 2. példában említettel azonos terméket kapunk. Kitermelés: 50 mg. [a]D 25 =-55°±2(c = 0,5 víz) 1^:0,5 Rf 2 :0,l. Standardként CIBA Hypertensin-t használva a hormon biológiai aktivitása teljes egyezést mutat a CIBA Hypertensin hatásával. 40 45 50 55 60 számított: talált: C =50,39%, N = 16,13%, C =50,54%, N = 16,20%, H =6,8 Cl = 3,33%, H =6,63%, Cl = 3,18%. 65 6. példa Asn1 -Val 5 -Angiotenzin-II.-Phe 8 I( 3 H) (16. vegyület) *~ A 15. vegyület acetátsójából 20 mg-ot 0,1 ml víz és 1 ml dimetil-formamid elegyében két csepp trietil-amin és 10 mg Pd/C katalizátor (10%-os fémtartalommal) jelenlétében a 3. példában említett módon triciumgázzal redukáljuk. A triciumfelvétel 660Hgmm-en közel 1 óra alatt játszódik le. A katalizátor kiszűrése után az oldószert eltávolítjuk és a maradékot még kétszer vízzel bepároljuk. Végül az anyagot éterrel eldörzsöjük. Kitermelés: 11 mg. Rf 2 :0,l. Fajlagos aktivitása: 1 7 mCi/mg Moláris aktivitása: 2,0 Ci/mmól A hormon radiokromatogramja csúcsot tartalmaz a CIBA Hypertensinnel megegyező helyen. A radioaktív vegyület teljes biológiai aktivitással rendelkezik. Szabadalmi igénypont: Eljárás az I általános képletű oktapeptidek -ahol R jelentése H-Asn-Arg-Val- tripeptidcsoport, Rí -Val-His-Pro- tripeptidcsoportot jelent, Xjelentése hidrogén-, trícium- vagy brómatom, és Y hidrogén-, klór- vagy triciumatomot jelent, azzal a megkötéssel, hogy az aminosavak L-konfigurációjúak és ha Y hidrogénatomot jelent, akkor X jelenetése brómatom —, valamint savaddíciós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan I általános képletű vegyületek, ahol X bróm- vagy hidrogénatomot és Y klór- vagy 7
