171615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új oktapeptidszármazékok előállítására
9 171615 10 e) Z-Asn-Arg(N02 )-Val-Tyr(Br 2 > -Val-His-Pro-Phe-OtBu (6. vegyület) 1,777 g (2,0 mmol) 5. vegyületet 13 ml dimetil-formamidban feloldunk, majd az oldatot —30C°-ra hűtjük. Keverés közben az oldathoz 0,55 ml (0,43 g, 2,32 mmól) tributil-amint, majd 5 perc múlva 0,2 ml (0,226 g, 2,08 mmól) klórhangyasav-etilésztert adunk. A reakcióelegyet ezután 25 percen át —30 C°-on keverjük. Ekkor a reakcióelegyhez adjuk 1,305 g (2,3 mmól) H-Val-His-Pro-Phe-OtBu 5 ml tetrahidrofuránnal készült oldatát, amely oldatot előzőleg -30C°-ra hűtjük. A beadagolás időtartama közel 5-8 perc. A reakcióelegyet —30 C° és -15 C° között 2 órán át keverjük, majd egy éjjelen át jégszekrényben állni hagyjuk. A kapott oldatot vákuumban bepároljuk. A maradékot 8 ml metanolban oldjuk és az oldathoz 40 ml vizet adunk. A kivált anyag digerálással szilárd anyaggá esett szét. Az utóbbit szűrjük, előbb vízzel, majd 2% piridint tartalmazó vízzel, majd ismét vízzel, ezután 5%-os citromsav-oldattal, végül vízzel mossuk és vákuumban szárítjuk. A kapott halványsárga anyag súlya 2,310 g. f) Z-Asn-Arg(N02 )-Val-Tyr(Br 2 > -Val-His-Pro-Phe-OH (7. vegyület) 2,267 g 6. vegyületet feloldunk 12 ml trifluorecetsavban, majd a kapott oldatot állni hagyjuk egy órán át. Az oldathoz ezután 60 ml étert adunk, amikor is szilárd anyag válik ki. Ezt egyórán át jégszekrényben állni hagyjuk, szűrjük, éterrel mossuk és szárítjuk. A kapott színtelen szilárd anyag súlya 2,208 g. Ezt az anyagot 10 ml, majd 5 ml vízzel mossuk és vákuumban szárítjuk. A kapott anyag súlya 1,879 g. A fenti anyagból 1,824 g-ot feloldunk 6 ml 20 : 6 :11 arányú piridin-ecetsavas-víz elegyben, majd 9 ml etilacetátot adunk az oldathoz. Az így kapott oldatot 200 g Kieselgel 60-ból (gyártja a Merck NSZK-beli cég) készült oszlopra visszük. Az eluálást 60 : 20 : 6 : 11 arányú etilacetát-piridin-ecetsav-víz eleggyel végezzük. A frakciókból vékonyrétegkromatogramot készítünk, és az Rf3 :0,33 frakciókat gyűjtjük. Az oldószert ezután vákuumban bepároljuk, a maradékot 10 ml etanollal felvesszük és lassan 20 ml vizet adunk az etanolhoz. Géles anyag válik ki. Ekkor a szuszpenziót 10 csepp ecetsavvá enyhén savanyítjuk, majd egy éjjelen át jégszekrényben állni hagyjuk, szűrjük, vízzel, majd éterrel mossuk és vákuumban szárítjuk. Csaknem színtelen anyagot kapunk. Súlya: 0,948 mg. Rf 3 :0,33. [a]D =-18°(c=l,DMF). g) H-Asn-Arg-Val-Tyr(Br2 )-Val-His -Pro-Phe-OH (8. vegyület) 177 mg 7. vegyületet 0,2 ml anizolban szuszpendálunk, majd hozzáadunk 2 ml cseppfolyós hidrogén-fluoridot. A reakcióelegyet ezután 1 órán át 0C -on tartjuk, miközben időnként enyhén rázogatjuk. Ezután 25 ml vízmentes étert adunk az oldathoz, miközben szilárd anyag válik ki. Egy óra múlva dekantáljuk és a csapadékot éterben ismét 5 szuszpendáljuk. Fél óra múlva szűrjük, éterrel mossuk, és vákuumban szárítjuk. A kapott fehér kristályos anyag súlya 154 mg. A fenti anyagból 135,5 mg-ot 10 ml vízben oldunk, a kapott odátot szűrjük, majd 25 ml Amber-10 lite IRA 400 (acetátformájú) gyantára (gyártja a Rohm and Haas Amerikai Egyesült Államok-beli cég) visszük. 5 ml-es frakciókat szedünk, a 3—20. frakciókat összeöntjük, majd vákuumban bepároljuk. A maradékot 2 ml etanollal eldörzsöljük, 15 majd 20 ml étert adunk a szuszpenzióhoz, szűrjük és vákuumban szárítjuk. Színtelen anyagot kapunk: Súlya: 115,5 mg. Rf 2 :0,23 R f *: 0,5. 20 2. példa (felhasználási példa) 1. vegyület előállítása 25 A 8. vegyületnek az 1. példa g) lépésében előállított acetátjából 80 mg-ot 0,5 ml vízben oldunk és 0,2 ml trietil-amin adunk az oldathoz. Az oldatot ezután 1 ml dimetil-formamidban 20 mg Pd/C katalizátorhoz (10%-os fémtartalommal) adjuk. A 30 reakcióelegyet ezután keverés közben katalitikusan hidrogénezzük. A hidrogénfelvétel megszűnése után a reakcióelegyet szűrjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot 2 ml vízben oldjuk és karboximetil-cellulóz oszlopon engedjük keresztül pH 5,5-ös 35 ammónium-acetát pufferrel gradiens eluciót alkalmazva (0,01-0,1 mólos gradiens). A frakciók Angiotenzin-II tartalmát vékonyrétegkromatográfiával állapítjuk meg standardként CIBA Hypertensin-t használva. Az Angiotenzin-II tartalmú 40 frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. így 31 mg szilárd anyaghoz jutunk. Rf *: 0,5 Rf2 :0,2. A fenti módon előállított Angiotenzin-II biológiai aktivitása megegyezik a standard CIBA preparátum aktivitásával. 3. példa (felhasználási példa) 50 Asn1 -Val 5 -Angiotenzin-II-Tyr 4 -( 3 H) (2. vegyület) A 8. vegyületnek az 1. példa g) lépésében előállí-55 tott acetátjából 25 mg-ot 0,1 ml víz és 1 ml dimetil-formamid elegyében oldunk, majd 2 csepp trietil-amin és 10 mg Pd/C katalizátor (10% fémtartalommal) jelenlétében hordozómentes triciumgázzal dehalogénezzük Márton és Kovács korábban 60 említett módszere szerint. A triciumgáz-felvétel megszűnése után a reakcióelegyet szűrjük, liofilizáljuk. A maradékot vízben oldjuk és az oldathoz 3 csepp jégecetet adunk, majd ismét liofilizáljuk. A habszerű szilárd maradékot kétszer 2 ml hideg víz-65 mentes etanollal eldörzsöljük, majd dekantálunk, 5
