171574. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkálifém- vagy ammónium-inzulin előállítására

171574 Az 1. ábra a nátrium-inzulin kiindulási anyag, a 5. példa 2. ábra a végső nátrium-inzulin elektroforézises elemzését mutatja. Az ábrákon látható zónák jelentése: 1 poliakrilamid gél nem-inzulin fehérjék inzulin és inzulin-jellegű fehérjék 1 poliakrilamid gél 6 7 8 9 10 nem-inzulin fehérjék inzulin vagy inzulin-jellegű fehérjék }' A 4. példában előállított cink-inzulin oldat 100 ml-es alikvotjához 1,4 g (0,033 mól lítium-klo-5 ridot adunk. Az oldat pH-ját 6,2 ml 1 n lítium-hidroxiddal 8,2-re állítjuk be. A zavaros oldatot etilén-diamin-tetraecetsawal kezeljük, a 8,2 pH-értéket 1 n lítium-hidroxiddal stabilizáljuk, a 4. példa eljárását követve. A kristályosítást is a 4. példa 10 szerint hajtjuk végre, ahhoz hasonló eredménnyel. A képződött lítium-inzulint a 4. példába leírtak szerint összegyűjtük, kitermelés 1,234 g (61,6%), aktivitás 27,8 E/mg, lítiumtartalom 2,37%, nedvességtartalom 3,6%. 15 3. példa Megismételjük a 2. példa eljárását, de kiindulási anyagként sertés-hasnyálmirigyből izolált nátrium- 20 -inzulint használunk, melynek aktivitása 25,0 E/mg. A nátrium-inzulin végső kitermelése 1,862 g (93,1%), és aktivitása 28,9 E/mg. A kiindulási anyagot (3. ábra) és a 3. példa 25 végtermékét (4. ábra) poliakrilamid gél-elektroforézissel vizsgáljuk a 2. példában leírtak szerint. Ezeken az ábrákon a zónák jelentése: Az 1-4. ábrán látható, hogy az eljárás eltávolítja a nem-inzulin fehérjéket. Ezenfelül a végső alkálifém- vagy ammónium-inzulin tisztaságában bekövetkezett nagyfokú javulást az aktivitás és más adatok egyedül nem tükrözik. 4. példa 6g kristályos cink-inzulint (70% marha-inzulin, 30% sertés-inzulin az 1. példában leírtak szerint elkészített 300 ml savas-fenolos vízben oldjuk. Az oldat 100 ml-es alikvotjához 2,5 g (0,033 mól) kálium-kloridot adunk. A kissé homályos oldat pH-ját 3,5 ml 10% vizes kálium-hidroxiddal 8,2re állítjuk be. A képződött zavaros oldathoz 0,3 g (0,001 mól) etilén-diamin-tetraecetsavat adunk. Az oldat pH-ját 10% kálium-hidroxiddal újra 8,2-re állítjuk be. Az oldatot környezeti hőmérsékleten (körülbelül 25 C°) 48 óráig keverjük, a kristályosodás és első 12 órában megindul. A képződött kálium-inzulint centrifugálással összegyűjtjük, kétszer abszolút alkohollal és egyszer éterrel mossuk, majd vákuumban szárítjuk. A kálium-inzulin kitermelése 1,736 g (86,8%), aktivitása 24,9 E/mg, káliumtartalma 1,48% és nedvességtartalma 10,10%. 6. példa Megismételjük 5. példa eljárását, de lítium-klorid helyett 1,8 g ammónium-kloridot és lítium-hidroxid helyett 60ml In ammónium-hidroxidot használunk. Az etilén-diamin-tetraecetsavat hozzáadva és a pH-t ammónium-hidroxiddal beállítva 24 óra alatt nem következik be kristályosodás. Tovább 1,8 g ammónium-klorid hozzáadása és 24 órás keverés után a kristályosodás megindul. A képződött ammónium-inzulint a 4. példában leírtak szerint izoláljuk, kitermelés 1,018 g (50,9%), aktivitás 30 27,6 E/mg, nedvességtartalom 7,3%, az inzulin 0,08% szulfáthamut ad. 35 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás alkálifém- vagy ammónium-inzulin előállítására, azzal jellemezve, gigy cink-inzulint, etilén-diamin-tetraecetsav-tetranátriumsót és alkálifém-40 vagy ammóniumionokat és adott esetben legfeljebb 0,4 térfogat% koncentrációban tartósítószert tartalmazó lúgos vizes oldatot készítünk, melyben a cink-inzulin koncentrációja 10-1000 E/mg, az alkálifém- vagy ammóniumionok koncentrációja 45 0,2—1,0 mól, az oldat pH-tartománya 7,6—8,6, az etilén-diamin-tetraecetsav-tetranátriumsó koncentrációja 0,0002-0,05 mól, az etilén-diamin-tetraecetsav-tetranátirumsó és a cink-inzulinban a cink aránya 3 :1-300 :1, majd a kapott alkálifém- vagy 50 ammónium-inzulint kristályosítással elkülönítjük a reakcióelegyből. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja alkálifém-inzulinok előállítására, azzal jel-55 lemezve, hogy a cink-inzulinból alkálifém-ionokat tartalmazó lúgos vizes oldatot készítünk. 3. Az 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja nátrium-inzulin előállítására, azzal jellemezve, hogy a cink-inzulinból nátrium-ionokat tar-50 talmazó lúgos vizes oldatot készítünk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a cink-inzulinból olyan lúgos vizes oldatot készítünk, amely legfeljebb 0,4 térfogat% koncentrációban tartósítószert is 65 tartalmaz. 4