171574. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkálifém- vagy ammónium-inzulin előállítására

3 171574 4 gyakran tartalmaz cink-inzulinban elő nem forduló nem-inzulin jellegű fehérje alkotórészeket, vagy pedig a korábbi elegyeket alkalmazzuk a velük kapcsolatos összes problémával együtt. A rajzok a kiindulási anyagként használt nátrium-inzulin, valamint a 2. és 3. példa nátrium-inzulin-termékének poliakrilamid géí-elektroforézises elemzését mutatják be. A leírásban használt „alkálifém" megjelölés a periódusos rendszer lA-csoportjának elemeire vonatkozik (Kiadó: Robert C. Weast, „Handbook of Chemistry and Physies", 53, kiadás, The Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, 1968, B-3. oldal). Előnyben részesítjük a lítiumot, nátriumot, káliumot, legelőnyösebben nátriumot használunk. Mint említettük, a találmány szerinti eljárásban a cink-inzulin lúgos vizes oldatát állítjuk elő, amely még EDTÁ-t és alkálifém- vagy ammóniumionokat is tartalmaz. Az oldat pH-ja általában körülbelül 7,6—8,8 között változik, az előnyben részesített pH-érték 8,2. A cink-inzulin koncentrációja 10—1000 nemzetközi egység per milliliter oldat (E/ml). A cink-inzulin előnyben részesített koncentrációja körülbelül 500 E/ml. A cinknek az inzulinból való eltávolítása és az alkálifém- vagy ammónium-inzulin gyors kristályosodása érdekében az EDTA és a cink-inzulinban levő cink aránya legalább 3 :1 legyen. Kisebb arányoknál az alkálifém- vagy ammónium-inzulin igen kis sebességgel kristályosodik ki a lúgos oldatból. Ezen felül kisebb arányok esetében növekszik annak a valószínűsége, hogy bizonyos mennyiségű cink kötve marad az inzulinhoz. Következésképpen az EDTA koncentrációja legalább 0,0002 mól legyen, de 0,05 mól is lehet. Körülbelül 500 E/ml cink-inzulin koncentrációnál az EDTA előnyben részesített töménysége körülbelül 0,01 mól. Az eljárásban használt cink-inzulin lúgos vizes oldatának alkálifém- vagy ammóniumionokat is kell tartalmaznia. Általában az alkálifém- vagy ammóniumionok koncentrációja körülbelül 0,2 mól-1,0 mól között változhat. Az alkálifém- vagy ammóniumionokat bármilyen vízoldható vegyület szolgáltathatja, amelynek az alkalmazott reakciókörülmények között nincs káros hatása az inzulinra. Ezenkívül az alkálifém- vagy ammóniumionokat egynél több ilyen vízoldható vegyület is leadhatja. Természetesen a kívánt alkálifém- vagy ammónium-inzulin kationja meghatározza ezen ionok minőségét. A kívánt alkálifémionok egy részét az EDTA révén biztosítjuk. A kívánt ionok azoknál a bázikus alkálifém- vagy ammóniumvegyületből is származhatnak, amelyek az oldat lúgos pH-jának a beállítására szolgálnak. Végül a szükséges ionokat alkálifém- vagy ammóniumsó is szolgáltathatja, melynek anionja egyebek között klorid, bromid, fluorid, jodid, acetát, szulfát, foszfát és hasonló lehet. Előnyben részesítjük a klorid- és foszfátsókat és leginkább a kloridokat. Mint említettük, a használt alkálifém- vagy ammóniumionoknak azonosaknek kell lenniük a kívánt alkálifém- vagy ammónium-inzulin kationjával. Rendszerint a szükséges ionokat a három fenti anyag kombinációja szolgáltatja. Általában a találmány szerinti eljárásban hasz-5 nált cink-inzulin lúgos vizes oldatát a szakember előtt ismert bármilyen módszerrel elkészíthetjük. Mivel a lúgos vizes oldat valamennyi komponense oldódik az alkalmazott körülmények között, a lúgos vizes oldat elkészítésének módja nem kri-10 tikus. A cink-inzulin lúgos vizes oldatának előállítására alkalmas, előnyben részesített módszer szerint a cink-inzulint savas vizes közegben oldjuk, és a kapott oldatot, megfelelő bázissal meglúgosítjuk. 15 Általában az EDTÁ-t és a további alkálifém- vagy ammóniumionokat bármikor hozzáadhatjuk az oldathoz, akár szilárd alakban, akár vizes oldat formájában. Oldatot használva tekintetbe kell venni s térfogatnövekedést, hogy az alkotórészek végkon-20 centrációja a kívánt legyen. A cink-inzulin savas oldatának pH-ja 2,5—3,5 között változhat. Az oldat savassága bármilyen ásványi savval beállítható, bár előnyben részesítjük a sósavat. Az oldat pH- értéke előnyösen körül-25 belül 3, ennek eléréséhez a cink-inzulint célszerűen híg sósavban oldjuk. Szükség esetén a cink-inzulin savas vizes oldata tartósítószereket és/vagy más reagenseket, így izotóniás vegyületeket is tartalmazhat. Alkalmas tar-30 tósítószer például a fenol, metil-parabén és hasonlók. Megfelelő izotóniás vegyület például a glicerin, glükóz és hasonlók. Ha tartósítószert használunk, ennek mennj'isége legfeljebb 0,4 térfogat%, bár az előnyben része-35 sített koncentráció körülbelül 0,2%. Tartósítószerek használata előnyös, közülük előnyben részesítjük a fenolt. Megfigyeltük, hogy a fenol a kívánt alkálifém- vagy ammónium-inzulin kristályosodási sebességét is fokozza. 40 A cink-inzulin savas vizes oldatát alkalmas bázissal lúgosítjuk meg. Általában bázisként alkálifémvagy ammónium-hidroxidot, -karbonátot vagy más hasonló bázikus vegyületet használunk. A megfelelő hidroxidot előnyösen tömény vizes oldat formá-45 jában alkalmazzuk, hogy elkerüljük a cink-inzulin oldatának nagyobb mértékű felhígulását és a szilárd alkálifém-hidroxidok oldódásával járó hőképződést is. Mint említettük, az EDTÁ-t és az alkálifém-50 vagy ammóniumionokat bármikor hozzáadhatjuk a cink-inzulin oldatához. Például a cink-inzulint EDTÁ-t tartalmazó híg vizes sósavban oldhatjuk. Az EDTA azonban ,^ cink-inzulin savas oldatához is hozzáadható, vagy a már meglúgosított oldathoz 55 adjuk. Általában az EDTÁ-t a savas oldathoz adjuk. A cink-inzulin lúgos vizes oldatának előnyben részesített előálh'tásánál az alkálifém- vagy ammóniumionokat együtt adagoljuk az EDTÁ-val. To-60 vábbi ionokat szolgáltat a savas oldat meglúgosítására használt bázis. A még szükséges ionokat megfelelő mennyiségű alkálifém- vagy ammóniumsó hozzáadásával biztosítjuk. Ezt a sót szokás szerint az oldat meglúgosítása előtt adagoljuk, de ezt az 65 EDTÁ-hoz hasonlóan bármikor megtehetjük. 2