171519. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a libák parvo-vírusos megbetegedése (libainfluenza) elleni nempatogén legyengített élő vírus ill. az azzal készített vakcina előállítására
171519 3 4 A vázolt indokok alapján a találmány feladata tehát egy olyan csökkent virulenciájú vírusvariáns előállítása, amely 1. a fogékony korú (1-4 hetes) libákat klinikai tünetekkel jellemezhető formában nem betegíti meg, azok elhullását sem közvetve, sem közvetlenül nem idézi elő, és 2. kifejlett immunrendszerű tojólibákba oltva azokban olyan specifikus ellenanyagok termelődését váltja ki, amelyek a sziken keresztül a legveszedelmesebb korban védik a kislibákat. Ezt a feladatot úgy oldottuk meg, hogy az Országos Közegészségügyi Intézetnél 00148 szám alatt letétbehelyezett vírust embrionált libatojás aüantoisz üregébe fecskendezzük, az elpusztult libaembriók allantoisz-folyadékával sejttenyészetet oltunk be, a vírust a sejttenyészetben 37—41 C°-on legalább 30 passzázson át sorozatban tenyésztjük, majd a sejthez kötött vírust ismert sejtroncsolási módszerekkel felszabadítjuk és kívánt esetben ismert módon vakcinává alakítjuk. A kiindulási vírusként alkalmazott vírus a libák parvovírusos betegségének „B" jelű virulens vírustörzse [Derzsy és munkatársai., Acta Vet. Acad. Sei. Hung. 20 419, (1970)]. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módja értelmében a vírussal libaembrióból nyert fibroblaszt típusú sejtszuszpenziót oltunk be. Ez esetben a szuszpenzióból szintén összefüggő sejttenyészet alakul ki, minthogy a vírus sejtroncsoló hatásának kifejtéséhez lényegesen több idő szükséges, mint az egyrétegű sejttenyészet kialakulásához. A szuszpendált állapotú sejttenyészet fertőzése előnyös, mivel a vírusok szaporodása kedvezően még az osztódásban levő sejtekben megy végbe. Tápfolyadékként a szövettenyésztéshez szokásos tápközegeket, például Difco-oldatot alkalmazhatunk, adott esetben adalékokkal kiegészítve. A legkedvezőbb inkubálási hőmérséklet 40 C°. A vírust a fenti körülmények között legalább 30 passzázson át sorozatban tenyésztjük, amikor is a vírusra jellegzetes sejtkárosító hatás [Magyar Állatorvosok Lapja 30, 199-201, (1975)] észlelésekor (kb. 5—7 nappal a fertőzés után) a tenyészetből ismert sejtroncsolási eljárásokkal a virionokat felszabadítjuk és friss tenyészetet oltunk be velük. Általában már a 30. sejtpasszázsban levő vírus az embrionált libatojást nem öli meg, noha abban szaporodik. Biztonsági okokból azonban célszerű, ha a vírust még mintegy 10 passzázson át továbbtenyésztjük és az embrionált libatojásra és fogékony naposlibákra kifejtett patogén hatását megvizsgáljuk. A megfelelő számú passzázson át adaptált vírust végül önmagában ismert sejtroncsolási eljárás, például többszörös fagyasztás és felolvasztás útján felszabadítjuk és készítménnyé alakítjuk. Tojólibák kezeléséhez az egyszeri dózis általában mintegy 0,5 • 10"s TCID 50 . (TCID S0 = a sejttenyészetet fertőző dózis fele). Ezt a dózist 1/2 ml folyadékban fecskendezzük a liba mellizmába, mégpedig a tojásrakási idő előtt. Két hét elteltével a kezelést megismételjük. Az így kezelt tojólibák tojásainak szikanyagában a vírusneutralizációs pró-5 bával is kimutatható ellenanyagok jelennek meg [Kisari és munkatársai, Magyar Állatorvosok Lapja 30, 721 (1975)]. Ezek az ellenanyagok a cikelt kislibák vérsavójába átmennek, abból kimutathatók, és a kislibákat a legveszélyesebb életkorban 10 (1—20. nap) a betegséggel szemben megvédik. A találmány szerinti eljárással tehát nagyüzemi mértékben és elfogadható költséggel olyan vakcina állítható elő, amellyel a libaállományok a parvo-15 vírusos megbetegedés ellen védhetők. A találmány szerint előállított vakcina előnye a hiperimmun szérummal szemben többek között abban áll, hogy a hiperimmun kezelésben a kislibákat kell részesíteni, míg a találmány szerint előállított 20 vakcinával a tojólibákat immunizáljuk, ami lényegesen kevesebb beavatkozást jelent. A találmányt az alábbi példákkal közelebbről megvilágítjuk anélkül, hogy oltalmi körét a példákban bemutatott foganatosítási módokra kor-25 látoznánk. 1. példa 30 A libák parvovírusos megbetegedése során embrionált libatojásban izolált, az OKI-nél 00148 szám alatt deponált virulens vírustörzsszuszpenziójával 10 napos embrionált libatojást az aüantoisz üregbe fecskendezéssel fertőzünk. Az 35 5-7 napi lappangási idő után elpusztult libaembriók allantoiszfolyadékát összegyűjtjük, majd ezzel beoltunk egy fibroblaszt típusú, 13-17 napos korú libaembrióból nyert sejtszuszpenziót. A vírussal fertőzött sejtszuszpenziót szövettenyésztésre 40 alkalmas üvegedénybe helyezzük, azt lezárva 40 C°-os termosztátban 7 napig inkubáljuk. Tápfolyadékként Earle TC (Difco) oldatot használunk, kiegészítve 2,2 g/liter nátriumhidrogénkarbonáttal, 5 g/liter hidrolizált laktalbuminnal és 5%-os 45 mennyiségben fetalis borjúsavóval. Az egyrétegű sejttenyészet kialakulása után (a telepítés után 24 órával) a tápfolyadékot fenntartó folyadékra cseréljük fel. A fenntartó folyadék összetétele megfelel a tápfolyadékénak azzal a különbséggel, 50 hogy a fenntartó folyadék csak 3% borjúsavót tartalmaz. 5-7 nappal a fertőzés után, a jellegzetes sejtkárosítás bekövetkeztével a tenyészetet háromszor fagyasztjuk és felolvasztjuk a sejthezkötött 55 virionok kiszabadítása céljából. Azokkal friss tenyészetet oltunk be, és a fentiekhez hasonló módon a vírust még 36 passzázson át szaporítjuk. Utána a legyengített vírust felszabadítjuk és vakcinává alakítjuk. 2. példa Az 1. példa szerint kapott, legyengített vírust 65 25« 10 5 TCIDjo; mennyiségben; üvegampullába 2
