171452. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és készülék folyadékok, különösen vér, hormonkoncentrációjának meghatározására radioaktív úton megjelölt anyagok alkalmazásával
9 171452 10 c) A TBG-kapacitás meghatározása: A betegtől, akinek pajzsmirigyfunkcióját meg kell vizsgálni, mintegy 5 ml vért veszünk. Az alvadás és a vértestek centrifugálása után nyert szé- 5 rumból 0,2 ml-t 3,3 ml T3 x -oldatot tartalmazó, polipropilénből készült mérőcsőbe pipettázunk, amelyre felhelyezzük az 1 -3. példák szerint előállított adszorpciós csövet, majd lezárjuk a készüléket és mintegy 10 percig állni hagyjuk. Ugyanígy 10 járunk el az alapszérummal is. Ezen idő alatt furatos detektorban vagy automatikus működésű gamma-mintaváltóban megmérjük a folyadékok teljes aktivitását. A készülékeket ezután rotátorba fogjuk be és 13 fordulat/perc sebességgel egy óráig 15 forgatjuk, majd függőleges helyzetbe hozzuk, hagyjuk, hogy az adszorpciós csőben levő folyadék lefolyjon, majd megmérjük a folyékony fázis maradó aktivitását, mindkét készülék esetében. Kiszámítjuk a G = maradó aktivitás : kezdeti aktivitás 20 hányadost mind a beteg szérumára, mind az alapszérumra vonatkozóan, majd összevetjük a kettőt. A beteg szérumának tiroxin-kötéskapacitását (TBK) az alábbi egyenlet szerint számítjuk ki: 25 C (a beteg szérumánál) TBK [%]= • 100 G (az alapszérumnál) Hipotireózis esetén a TBK-érték a normál szé- 30 rumhoz viszonyítva általában nő, hipertireózis esetén viszont csökken. Az alapszérumnál G = 70%-os értéket és egy normális pajzsmirigy működésű ember szérumánál G = 65%-os értéket kapunk. Ebből a 2 értékből 35 TBK = 92,9% adódik. Pajzsmirigy túltengéses betegnél megfelelően G = 56% és TBK = 80%. Hipotireózis esetén a G-érték magasabb. Egy normális tartomány megállapításakor egy normális közösség TBK értékeit ajánlatos megadni. 40 Az eljárás reprodukálhatósága igen jó, azonos számú alkalmazása esetén ± 1,5%—2,0%. 5. példa 45 Szérum tiroxinkoncentrációjának meghatározása A vizsgált szérumból és az ismert mennyiségű, 50 meg nem jelölt T4 -et tartalmazó kontrollszérumból 0,5—0,5 ml-t egy-egy centrifugálható csőben 1,0-1,0 ml alkoholhoz adunk és centrifugális keverővel 30 másodpercig keverünk. A keveréket 10 percig állni hagyjuk, majd a denaturált pro- 55 teineket 2500 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. Az alkoholos extraktum az eredetileg jelenlevő T4 72%-át tartalmazza (extrakciós hozam). A vizsgált szérum tiroxintartalmának meghatározása céljából annak alkoholos extraktumából 60 0,3 ml-t mérőcsőbe pipettázunk, amely 3,3 ml ismert, oszlopkromatográfiás módszerrel (lásd az irodalmi adatot a továbbiakban) előállított TBG-oldatot tartalmaz, amelyben 0,02 (iCijml aktivitású 125j-vel megjelölt tiroxin van feloldva. Az alap- 65 görbe felállítása céljából 0,3-0,3 ml mennyiségű 5, illetve 20 ixg jelöletlen tiroxin/lOOml koncentrációjú alapoldatokat hasonlóképpen kezelünk. Ezután felhelyezzük az adszorpciós csöveket, lezárjuk a készülékeket és alapos atkeverés után 3—5 sec, megmérjük az oldatok teljes aktivitását. A szabad T4 — l25 J adszorpciója céljából a készülékeket rotátoron 13 fordulat/perc sebességgel 60 percig forgatjuk. A készülékeket ezután függőleges helyzetbe hozzuk, hogy az oldatok az adszorpciós csövekből visszafolyjanak a mérőcsövekbe, aholis megmérjük a maradó radioaktivitásokat. Minden mintára kiszámítjuk a maradó aktivitás G = • 100 teljes aktivitás hányadost. Az alapmintáknál kapott értékeket az alapoldatokban levő tiroxin mennyiségének függvényében ábrázoljuk és az így kapott két ponton át egyenest rajzolunk. Ezzel megkapjuk az alapgörbét. A vizsgált szérum ismeretlen koncentrációja az alapgörbéből a G hányados segítségével határozható meg. A szérum tényleges tiroxintartalma a leolvasott értéknek és az extrakciós hozamnak a hányadosából adódik. A fenti TBG-oldatot a szérum oszlopkromatográfiás tisztítása során nyert, meghatározott TBG-tartalmú frakcióból [K.Heide és H. Haupt, Behringwerke Mitteilungen, Band 43 (1964), 161 old. szerinti ún. II leöntés] állítjuk elő. A megfelelő frakciót először vízzel szemben dializáljuk, majd 0,1 m trisz-(hidroximetil)-aminometán-HC1 pufferoldattal 0,022 g/100 ml teljes proteintartalomra hígítjuk. Stabilizálás és konzerválás céljából 0,02 súly% nátrium-azidot adunk az oldathoz. 6. példa A trijód-tironin radioimmunológ meghatározása A pajzsmirigyhormonnak, azaz a trijódtironinnak a radioimmuniológiai meghatározásához a találmány szerint a találmány szerinti készülékkel a következő oldatokat pipettázzuk be: egyenként 0, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 mg T3 /ml-t tartalmazó 100 /jl alap szérumot, vagy 100 /ül beteg-szérumot, hozzá 100 ßl legalább 10 000 impulzus/perc T3 125 J oldatot, 100 ni T3 -antitestet tartalmazó 1 :20 000 hígítású T3 -antiszérumot 2,0 ml desztillált vizet. Ebben az oldatban képződik a T3 -antitest komplex. A mérőcsöveket szobahőmérsékleten állni hagyjuk éjjelen keresztül és ezidő alatt az össz-radioaktivitást alkalmas mintaszámlálóval, például automatikus gamma-mintaváltóval mérjük. Ez -után feltesszük az 1-3. példákban leírt adszorpciós csövet, az egész készüléket rotátorra erősítjük és 1 óráig forgatjuk. A készüléket ezután levesszük a rotátor-5
