171339. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12-vitamin tartalmú fermentlevek feltárására és sejtmentesítésére
11 171339 12 séklet elérése után (kb. 10 perc) 30 percig keverjük, majd ugyancsak keverés közben 40 ml 30 s%-os (FeCl3 . 6H2 0-ra számolva) vas(III)-kloridot mérünk az elegyhez. 10 perc múlva 20%-os nátriumhidroxiddal az oldat pH-ját 8 ±0,2 közötti értékre állítjuk, ehhez kb: 30 ml nátriumhidroxid szükséges. A pH-t finomskálás indikátorpapírral ellenőrizzük. 10 percnyi keverés után az elegyet G3-as, nagyméretű (0 12—15 cm) üvegszűrőn szívatással szűrjük, vagy centrifugáljuk. A viszonylag nagymennyiségű vas(III)-hidroxid csapadék zárványként aránylag sok vitamint tart vissza, ezért 2 X 100 ml 70 C°-os vízzel, melyhez 0,25—0,25 ml 1%-os nátriumcianidot és 1—1 csepp 20%-os nátriumhidroxidot adunk, a csapadékot felszuszpendáljuk, majd erősen leszívatjuk. Centrifugálás esetén a csapadékot 3 X 150 ml fenti összetételű mosóvízzel felszuszpendáljuk és újból centrifugáljuk. A szűrletet 1 literes rázótölcsérbe mossuk és 1: 1 arányú fenol-kloroform elegygyel az oldat B12-vitamin tartalmát és a faktorokat extraháljuk. Összerázás után kb. 1,0 ml 1:1 hígítású ecetsavat adunk az elegyhez (összerázás nélkül, csupán egy-két körkörös mozgást végzünk), ezzel a fázisok szétválását gátló emulzió-képződés megszüntethető. A fermentlé minőségi ingadozásaitól függően az ecetsav mennyisége az emulzió megtöréséig szükség szerint növelhető. Háromszori, kb. 50—50 ml fenol-kloroformmal végzett extrakció után, az egyesített szerves fázist kb. 150 ml desztillált vízzel mossuk, a fázisok különválását 5 ml 1: 1 hígítású ecetsavval segítjük elő. Ha a vizes mosáskor erősebb emulzió képződés tapasztalható, a vizes mosást megismételjük. A fenol-kloroformos fázishoz azonos térfogatú acetont és annyi kloroformot adunk, míg az oldat erősen opálossá válik. Ezután 40—50 ml desztillált vizet adunk hozzá, erőteljesen összerázzuk, s ezzel a B12 -vitamint és a faktorokat a felső, vizes fázisba szorítjuk át. Az utóbbi műveletet annyiszor ismételjük, míg a felső vizes fázis már nem színeződik. Az egyesített vizes fázisokat rázótölcsérben kloroformmal fenolmentesre mossuk, majd térfogatától függően normállombikban 200, illetve 250 ml törzsoldatot készítünk belőle. A várható koncentrációtól függően az oldat 10—20 ml-es részleteit porcelántálban, vízfürdőn szárazra pároljuk, ezután a szilárd maradékot 1—2 ml desztillált vízben feloldjuk és mikropipetta segítségével 20 X 20 cm nagyságú Whatman-1 vékony futtató papírra visszük. A jó elválasztás érdekében a mintát a papír teljes szélességében visszük fel a papírra. A futtatást 80 C°-on végezzük, az alábbi összetételű .futtatószert használjuk: 108 ml desztillált vízben feloldunk 0,4 g káliumperklorátot, és 0,6 ml 10%-os nátriumcianid oldatot adunk hozzá. 320 ml szek-butanol hozzáadása után az elegyet kitisztulásig rázzuk. A kromatogramok vizsgálatát természetes és UV fényben Végezzük. 2,5 óra futtatási idő betartásával kapunk tökéletesen szétvált sávokat, ennél rövidebb vagy hoszszabb idő a sávok egymásba mosódását eredményezi. A B12-vitamint UV fényben ceruzával körülhatároljuk, majd a kivágott foltot vékony csíkokra vágjuk, kémcsőbe helyezzük és bürettából ismert térfogatú, a koncentrációtól függő mennyiségű (10—20 ml) 0,1%-os nátriümcianid oldatot adunk hozzá és 20 percig állni hagyjuk. Ezután összerázzuk és kis üvegtölcsérbe (03 cm) forrasztott G2-es zsugorított üveglapon megszűrjük. Az így kapott oldatot fotometráljuk és koncentrációját tiszta B12 -vitamin 0,1% nátriumcianidot tartalmazó oldatára felvett kalibrációs görbéről határozzuk meg. A kalibrációs görbe felvételét és a mérést azon a 5 hullámhosszon végezzük (541 vagy 361 nm körül), ahol a B12 -vitamin-oldat extinkciója az adott méréstartományú műszeren maximális. Dúsított fermentlé B12 -vitamin tartalmának meghatározásánál a fermentlevet desztillált vízzel kétszeresére 10 hígítjuk. A fermentlé tényleges B12 szintjének meghatározása érdekében elengedhetetlenül szükséges, hogy a mintavétel tökéletesen homogenizált fermentléből történjék. A találmány szerint feltárt és sejtmentesített szüredék 15 BI2 -vitamin tartalmának meghatározásánál a módszert értelemszerűen a vas(III)-hidroxiddal képzett és kimosott csapadék szüredéke után kezdődő lépésétől végezzük. A példákban megadott B^-vitamin értékek 1 literre 20 vonatkoznak és három párhuzamos mérés átlagai. 1. példa 1000 ml 10 500 gamma B12 -vitamin tartalmú, a 25 159 356 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás szerint félfolyamatos eljárással készített, az Országos Közegészségügyi Intézetben 76, 77, 78 és 79. szám alatt deponált Corynebacterium sp.-t (jelzése 24A1), Corynebacterium sp.-t (jelzése 62B9), Lactobacillus sp.-t (jel-30 zése 244B/C1) és Propioni bacterium sp.-t (jelzése 239A1/6) tartalmazó mezofil, metántermelő vegyes mikropopulációjú fermentlevet 1500 ml-es, háromnyakú, keverővel és hőmérővel ellátott lombikba mérünk, majd szobahőmérsékleten 10 ml 1%-os nátrium-35 cianid-oldatot (0,1 g NaCN) és 20%-os nátriumhidroxid-oldatot (körülbelül 5 ml) adunk hozzá, ily módon a fermentlé pH-értékét 9 + 0,2-re állítjuk be. Az elegyet állandó keverés közben vízfürdőn 70 C°-ra melegítjük és ezen a hőmérsékleten 30 percig keverjük. Ezután 40 50 ml 30%-os vas(III)-klorid oldatot (17,4 g FeCl3 . 6H2 0) adunk hozzá, 10 percig keverjük, majd 20%-os nátriumhidroxid oldattal (kb. 35 ml) az elegy pH-értékét 8 ± 0,2-re állítjuk be. További 10 percnyi keverés után a reakcióelegyet zsugorított üvegszűrőn szűrjük, 45 jól leszívatjuk, majd kevés vízzel mossuk. A szüredék B12 -vitamin-tartalma 10290gamma. Kitermelés: 98,0%. 2. példa 50 Mindenben az 1. példa szerint járunk el, azzal a változtatással, hogy 1000 ml 21 300 gamma Bi2 -vitamint tartalmazó, az 1. példában megadott fermentléből indulunk ki és a feltárásnál, illetőleg a vas(III)-kloridos 55 kezelésnél az elegy pH-értékét 20%-os kalciumhidroxid oldattal állítjuk be. A szüredék B12 -vitamin-tartalma 21 350 gamma. Kitermelés: 100,2%. (az analitikai meghatározás hibája). 60 3. példa 1500 ml-es lombikba 1000 ml 21 300 gamma Bj2 -vitamint tartalmazó, az 1. példában megadott fermentlevet 65 mérünk bé és szobahőmérsékleten 20 ml 1%-os nátrium-6
