171339. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12-vitamin tartalmú fermentlevek feltárására és sejtmentesítésére
3 171339 4 mikroorganizmusok maguk is termelnek B12 -vitamint, szabatosabban olyan korrinvázas vegyületeket, amelyek egy része B12 -vitaminná alakítható át. A B 12 -vitamin előállítását ipari méretekben leginkább steril körülmények között, speciális mikroorganizmus-törzsekkel végzik. A felhasznált törzsek többsége anaerob, mikroaerofil vagy fakultatív anaerob baktérium, mint például Propionibacterium freudenreichii, P. arabinosum, P. shermanü, Methanobacterium omelianski, Aerobacter aerogenes, bizonyos lactobacillus, Mycobacterium, Clostridium stb. félék. Legelterjedtebben a Methanobacterium vagy Propionibacterium genushoz tartozó törzseket használnak. A steril fermentáció kivitelezése azonban, különösen nagy méretek esetében, komoly műszaki feladatot jelent. Speciális nyomásálló készülékre, levegő-sterilező berendezésre, jelentős menynyiségű energiára és megbízható szakértő személyzetre van szükség. A kényes, steril fermentációknál előnyösebben és egyszerűbben állítható elő a B12 -vitamin és rokonvegyületei szeptikus körülmények között a szennyvíz-iszap rothasztásának maradékából. A rothasztott csatornaiszap B12 -vitamin tartalma a rothasztást végző vegyes baktériumflórából származik. Lényeges előrehaladást jelentett az ún. iszapmentes BI2 -vitamin termelési eljárás (153 740 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás), amelynek lényege, hogy a rothasztást előidéző vegyes baktérium-flórát speciális táptalajra sikerült adaptálni. Ily módon az eljárás függetlenné vált a csatorna-iszap valójában igen nagy ingadozást mutató vegyes baktériumflórájától és ezáltal konstans B12 -vitamin szintet biztosító eljárást sikerült megvalósítani. Ez utóbbi, szintén szeptikus körülmények között végzett fermentációs eljárás az idők folyamán igen nagy mértékben finomult, mert ma már az első szabadalmi leírásban ismertetett 6500 y/1 Bi2 -vitamin tartalmú fermentlével szemben, mintegy 40 000 y/1 B12 -vitamin szintet sikerült elérni a tápanyagok megfelelő megválasztásával, illetve a tápoldatok periodikus adagolásával. A B12 -vitamin mikroorganizmusok útján történő szintézisét nyomon kíséri a feldolgozási technológia fejlődése is, ugyanis önmagában nem elegendő magas szintű fermentlevet előállítani, hanem a hatóanyagot a sejtekből minél jobb hatásfokkal ki is kell nyerni, illetőleg a fermentáció során képződött egyéb korrinvázas vegyületekből felszabadítani és B12 -vitaminná átalakítani. A fermentlevek feltárására számos eljárás ismeretes. A 2 530416 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint igen sok mikroorganizmus B-vitamin mellett ún. B12 -vitaminszerű anyagokat is szintetizál. Ezen utóbbiak elválasztása a B12 -vitamintól meglehetősen körülményes. Ha a fermentációs tenyészetet, mint például Streptömyces griseus vagy annak alkalmas koncentrátumait cianidiont szolgáltató vegyületekkel reagáltatják, a B12 -vitaminszerű anyagok nagyrésze B12 -vitaminná alakul át és így a kinyerhető Bt2 -vitamin mennyisége lényegesen több lesz. A reakció előnyösen vizes közegben cianidionok feleslegének jelenlétében hajtható végre. Cianidiont szolgáltató vegyületként HCN-ot, NH4 CNrot, NaCN-ot, KCN-ot, Ca(CN)2 -ot, Sr(CN) 2 -ot és Ba(CN) 2 -ot alkalmaznak. A fenti szabadalmi leírás ismerteti első ízben a fermentlevek cianidionokkal történő kezelését, bár még csak a fermentlevekben oldott állapotban jelenlevő B12 -vitamin és egyéb korrinvázas vegyületek kinyerésénél. Számos későbbi szabadalmi leírás azonban már a sejtek feltárásánál is alkalmazza ezt az alapvető találmányt. 5 A 939 108 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerint a B12 -vitaminszérű anyagok átalakításához nem szükséges cianidiön, hanem előnyösen alkalmazhatók a cianidcsoportot komplex-, vagy szénatomhoz kötött formában tartalmazó nem toxikus 10 vegyületek (nitrilek) is. A leírás példáiban Streptömyces olivaceus fermentációs tenyészetét K.3[Co(CN)6 ], K4 [Fe(CN) 6 ], K 2 [Zn(CN) 4 ], glikolsavnitril, benzilcianid, vagy benzonitril jelenlétében egy órán át 95 Cc -on hőkezelik. Ily módon a mintegy 300—3000 B12 -vita-15 min/l tartalmazó fermentleveknél a mérgező cianidionos kezelésénél jobb, vagy azonos kitermelést érnek el. A 2 898 989 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint a B-vitamin előállítására 500 y/1 Bi2 -vitamin aktivitású 20 rothasztott csatornaiszapot, 1500 y/1 aktivitású Streptömyces griseus, vagy 1900 y/1 aktivitású Propionibacterium freudenreichii fermentációs tenyészetét használják. A Propionibacterium feltárását sejtszuszpenzióban mintegy 25% propanol jelenlétében, 80 C° hő-25 mérsékleten 30 percig 6,5 pH-értéken 0,2% V S0 2 vagy más, HSO~3 -ionokat szolgáltató vegyület jelenlétében végzik. Ily módon szulfito-kobalamin oldatot kapnak^ az oldatból a szulfito-kobalamint montmorrílloniton, majd aktív szénen adszorbeáltatják, ezután az eluátu-30 mot 720"ad térfogatra bepárolják, a sűrítményt cianidionokkal kezelik, ily módon jutnak a B12 -vitamirihoz. A 2 764 521 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint a Propionibacterium freudenreichii fermentlevéből centrifugálással vagy egyéb mó-35 don sejtsűrítményt állítanak elő, majd 60 tf% acetont adnak hozzá. A sejtek ekkor agglutinálódnak és a B12 -vitamin rokon vegyületei oldatba mennek. A 932 981 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerint a Bj2 -vitamin hatású anyago-40 kat termelő mikroorganizmusokat, például a Streptömyces griseus nedves micéliumát 5—8 pH-érték között toluol jelenlétében autolízisnek vetik alá. Az autolízist követően, vagy azzal egy időben a sejteket cianidokkal kezelik, 45 A 2 941 933 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint a metánfermentációnak alávetett csatornaiszap baktériumsejtjeit mintegy 8 órán át mésztejjel (0,5—3,0%) kezelik, majd az elegyet szűrik. Az elegy pH-értéke mintegy 13. 50 Ily módon az analitikailag meghatározható Bj2 -vitamin mennyiségének 44%-át nyerik ki. A 146 469 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban ismertetett eljárás a Bj2 -vitamin előállítására methanobacteriumos vagy propionibacteriumos fermentáció 55 fermentlevelét használja. A baktériumtesteket 8-as pH-értéken, rövid ideig tartó forralással tárják fel különleges feltárószerek, mint nátriumditíonit és/vagy VI vegyértékű krómot tartalmazó vegyületek jelenlétében. A feltárás hatásfoka a hasonló módon, de nátrium-60 cianid jelenlétében végzett feltárás kitermelésével azonos. A 144 197 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás eljárást ismertet B12 -vitamin tartalmú vizes sűrítmények kolloid szennyezésektől való tisztítására. Az eljárás 65 szerint a csatornaiszap feltárása útján nyert vizes kiß
