171243. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új dotriakontapeptidamidok előállítására
13 171243 14 ban) és 90 [i.1 terc-butil-nitritet adunk. A reakcióelegyhez 15 perc keverés után —10 cC-on 6 ml dimetil-formamidban oldott 410 mg H—Thr(tBu)—Phe— —Pro—Gin—Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly—Val— —Gly—Ala—Pro—NH2-t, és végül 260 [xl etil-diizopropil-amint adunk. A reakcióelegyet egy éjjelen át 0 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd a nyers terméket 100 ml éter hozzácsepegtetésével kicsapjuk. A nyers terméket Craig-extrakcióval metanol, puffer, kloroform, szén-tetraklorid 10:5:10:5 rendszerben (puffer a k) eljárásnál megadott) 200 szakasznál több, egyenként 3 ml fázistérfogattal tisztítjuk. A tiszta hexadekapeptidet a 18—37 számú frakciók (rmax = 27; K=0,16) szárazra történő bepárlásával és a puffer nagyvákuumban 40 °C-nál történő kiszublimálásával mint amorf port kapjuk. DS: Rf(43C)=0,40; Rf(52)=0,20; Rf(70)=0,58 n) H—Asn—Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)— —Phe—Pro—Gin—Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly— —Val—Gly—Ala—Pro—NH2—acetát 270 mg előbbiekben megadott Z-hexadekapeptidet 27 ml 80%-os ecetsavban 50 mg palládium-csontszénnel két óra hosszat hidrogénezünk. A katalizátort leszűrjük, a szűrletet körülbelül 3 ml-re betöményítjük és liofilizáljuk. DS: Rf(52)=0,07; Rj(96) = 0,28; R.f(107) = 0,65. o)Z—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Thr(tBu)—Gin— —Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)—Phe—His— —Thr(tBu)—Phe—Pro—Gin—Thr(tBu)—Asn— Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2 165 mg Z—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Thr(tBu)—Gin— —Asp(OtBu)—Phe—NHNH2 [Helv. 53, 2135 (1970)] és 2 ml dimetil-formamid oldatához —20 °C-on 117 [xl 3,24 n sósav-oldatot (dioxánban) és 21 jxl terc-butil-nitritet adunk. A reakcióelegyet 15 percig — 10 °C-on keverjük, melyhez 0 °C-ra lehűtött, 198 mg H—Asn— —Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu>—Phe—Pro—Gin— —Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala— —Pro—NH2—acetát és 4 ml dimetil-formamid oldatát, valamint 80 [i.1 etil-diizopropil-amint adunk, és egy éjjelen át 0 °C-on állni hagyjuk. A nyers terméket a reakcióelegy 40 ml éter és 20 ml petroléter elegyére történő csepegtetésével kicsapjuk és ezt követően Craig-extrakcióval metanol, puffer, kloroform, szén-tetraklorid 20:5:10:10 rendszerben (puffer a k) eljárásnál megadott) 300 szakasznál több, egyenként 3 ml fázistérfogattal tisztítjuk. A 98—117 számú frakciók (rmax = 107; K = 0,55) szárazra történő bepárlásával, és a puffer 40°C-on nagyvákuumban történő kiszublimálásával kromatográfiailag tiszta dokozapeptidet kapunk, mely amorf por. DS: Rf(43C)=0,39; Rf(52) = 0,30; Rf(96) = 0,48 p) H—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Thr(tBu)—Gin— —Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)—Phe— —His—Thr(tBu)—Phe—Pro—Gin—Thr(tBu)— —Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro— —NH2 260 mg Z-dokozapeptidet 26 ml 80%-os ecetsavban 50 mg palládium-csontszénnel 15 óra hosszat hidrogénezünk. A katalizátort leszűrjük, a szűrletet körülbelül 5 ml-re betöményítjük és liofilizáljuk. Az ecetsav eltávolítására a maradékot kétszer metanol és nátrium-hidrogén-karbonát-oldatból kicsapjuk. DS: Rj(43C)=0,31; Rf(100)=0,29 q) Boc—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)— • i :'í Thr(tBu)—Cys—Met—Leu—Gly—Thr(tBu)— —Tyr(tBu)—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe— —Asn—Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)—Phe—Pro— —Gin—Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly - Val—Gly— —Ala—Pro—NH2 170 mg p) eljárásban megadott dokozapeptidet és 101 mg Boc—Cys—Gly-Asn—Leu—Ser(tBu)—Thrí -(tBu)—Cys—Met—Leu—Gly—OH-t [Helv. 53, 556 20 1970)] 1,2 ml dimetil-formamidban melegítéssel oldunk, melyhez 15,8 mg N-hidroxi-szukcinimidet és 21,3 mg diciklohexil-karbodiimidet adunk és nitrogénáramban 3 és 1/2 óra hosszat 45 C C hőmérsékleten keverünk. A nyers terméket a reakcióelegyből ezután 20 mlpe-25 roxidmentes éterbe csepegtetve kicsapjuk. A tisztítást Craig-extrakcióval metanol, puffer, kloroform, szén-tetraklorid 11:3:6:7 rendszerben (puffer a k) eljárásnál megadott) több mint 450 szakaszban egyenként 3 ml fázistérfogattal folytatjuk le. A tiszta és védett dotria-30 kontapeptid-származékot a 190—210 számú frakciókból (rmax = 200; K = 0,8) bepárlással és a puffer kiszublimálásával különítjük el, melyet amorf por formában kapunk. DS: Rf(70)=0,53; Rf(10O)=0,35; Rf(52A) = 0,29. 2. példa Bmp—Gly—Asn—Leu—Ser—Thr—Cys—Met— —Leu—Gly—Thr—Tyr—Thr—Gin—Asp—Phe— —Asn—Lys—Phe—His—Thr—Phe—Pro—Gin— —Thr—Asn—Thr—Gly—Val—Gly—Ala—Pro— 45 —NH2—hidroklorid (Dezamino—Cys1 —Asn 26 —Thr 27 —kalcitonin M hidroklorid) 50 50 mg Bmp—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)-^Thr(tBü>— í —Cys—Met—Leu—Gly—Thr(tBu)—Tyr(tBu)— —Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc) —Phe—His—Thr(tBu)—Phe—Pro—Gin—ThrítBu)-t-| 55 —Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2-t az 1. példában megadott módon, 12 n sósav-oldattal 0 °C hőmérsékleten lefolytatott acidolízissel a megadott peptiddé alakítjuk. DC: Rj(45) = 0,50; Rj(101A)=0,59; Rj<112E)=0,43 60 Vékonyréteg-elektroforézis: pH 1,9; 16 volt/cm; lés 1/2óra; futási távolság a kátédhoz körülbelül 2,4 cm. A védett dotriakontapeptidamidot például a következő módon állítjuk elő: 65 61 mg Bmp—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thr(tBu)— © 7
