171217. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amiláz-inhibitor előállítására
7 171217 8 4. példa Egy 5% keményítőt, 1,0% élesztőkivonatot és 0,4% dikálium-hidrogén-foszfátot tartalmazó tápközeget az 1. példában leírt módon beoltunk az SE 50/13 törzs kultúrájával. így 4 napi fermentáció után oly fermentlevet kapunk, amely 105 000 AIE/ml aktivitású. 5. példa Egy 6% keményítőt, 1,3% élesztőkivonatot és 0,2% dikálium-hidrogén-foszfátot tartalmazó tápközeget az 1. példában leírt módon beoltunk az SE 50/13 törzs kultúrájával. Ily módon 4 napi fermentáció után oly fermentlevet kapunk, amely 120 000 AIE/ml aktivitású. 6. példa Egy üveg-fermentorban 8 liter tápközeget, amely a 2. példában megadott összetételű, rázólombikban készített 3 napos kultúrával oltunk be és erős keverés és levegőztetés közben 3 napig folytatjuk a fermentációt 28 °C hőmérsékleten. Az így kapott fermentlé 105 000 AIE/ml aktivitást tartalmaz. 7. példa 2 liter fermentlevet, amelynek aktivitása 100.106 AIE/liter, összaktivitása 200.106 AIE, 30—40%-os salétromsavval 2,5 pH-értékre állítunk be, majd 10 g aktívszenet adunk hozzá. 10 percig keverjük, majd percenként 15 000 fordulattal 20 percig centrifugáljuk a micélium és az aktívszén eltávolítása céljából. A tiszta folyadékot, amelynek térfogata 1,6 liter, aktivitása 95.106 AIE/liter, összaktivitása 152.106 AIE, ammónium-hidroxidoldattal semlegesítjük, 120 g aktívszenet adunk hozzá és 1 óra hosszat keverjük. Ezután 60 g cellulóz szűrési segédanyagot adunk az elegyhez, majd leszívatással szűrjük. A szűrőn maradt szilárd anyagot 500 ml vízzel, majd 500 ml 10%-os etanollal mossuk, azután 500 ml 35%-os, sósavval előzetesen 2,5 pH-értékre beállított acetont adunk hozzá, 20 percig keverjük, azután leszűrjük és ezt a műveletet újabb 500 ml 35%-os acetonnal megismétejük. Az acetonos szűrleteket egyesítjük, így 900 ml folyadékot kapunk, amelynek aktivitása 120.106 AIE/liter, összaktivitása 110.10 6 AIE. Az így kapott deszorbeátumot ammónium-hidroxidoldattal semlegesítjük és rotációs bepárlóban, 20 mmHg körüli nyomáson 50 ml térfogatra bepároljuk és keverés közben 40 ml metanolt adunk hozzá. A levált csapadékot elvetjük. A szűrletet élénk keverés közben hozzácsepegtetjük 500 ml száraz alkoholhoz. Az elegyet szívószűrőn leszűrjük, a szűrőn maradt, szilárd csapadékot etanollal és éterrel mossuk, majd vákuumban, szobahőmérsékleten megszárítjuk. Hozam 4,9 g, 14.106 AIE/g aktivitással, ami a kezdeti oldat aktivitására számítva körülbelül 34%-os hozamnak felel meg. Az említett állatkísérletek eredményeit az alábbi I. táblázatban, az embereken végzett keményítő-táplálási kísérletek eredményeit a II. táblázatban foglaltuk össze. 10; 15 20; 25; 30 35. 40 45 50-55 60; A 6. példa szerinti fermentlé 6 liternyi mennyiségét, (amelynek inhibitor-aktivitása 105.106 AIE/liter, összaktivitása 630.106 AIE) 20 °C hőmérsékletre történő lehűtés után féltömény (30—40%-os) salétromsavval 2,5 pH-ra állítunk be, 30 g aktívszenet adunk hozzá és 10 percig keverjük. Ezután percenként 10 000 fordulattal 15 percig centrifugáljuk és a kapott tiszta, világossárga levet (amelynek térfogata 5,1 liter, és amely 100.106 AIE/liter aktivitást és 510.106 —AIE osszaktivitást mutat) ammónium-hidroxidoldattal semlegesítjük és 500 ml térfogatra bepároljuk. Az így kapott koncentrátum aktivitása 970.106 AIE/liter, összaktivitása 485.10 6 AIE. A kapott 500 ml koncentrátumot 200 g Amberlite IRA 410 (Cl-) ioncserélő gyanta (a Serva cég, Heidelberg, gyártmánya) hozzáadásával 45 percig keverjük, majd leszívatással szűrjük és 4/5 térfpgatrész (=400 ml) metanolt adunk hozzá a nagyobb molekulájú keményítő-lebontási termékek fő tömegének és a még jelenlevő aktívszén-maradékoknak a kicsapása céljából. Ezután 5 percig centrifugálunk; a kapott 850 ml folyadékot, amelynek aktivitása 450.106 AIE/liter, összaktivitása 380.106 AIE, élénk keverés közben belecsepegtetjük 4 liter száraz alkoholba. A kapott fehér pelyhes csapadékot leszívatással szűrjük, etanollal háromszor, majd éterrel kétszer mossuk és vákuumban 50 °C hőmérsékleten megszárítjuk. 36 g fehér poralakú terméket kapunk, amelynek aktivitása 10.106 AIE/g, összaktivitása 360.10 6 AIE; ez az aktivitásra számítva 57%-os termelési hányadnak felel meg. 8. példa 9. példa 35 Az amiláz-inhibitorok hatásának kimutatása patkányon és emberen. Patkányoknak keményítővel történt táplálás után fellépő alimentáris hiperglikémia kiváltása céljából test-40 súly-kilogrammonként 1 g főzött keményítőt adunk be, orális úton. A kísérlethez 6—6 patkányból csoportokat alkalmazunk. További 6 patkánynak a keményítőn kívül amiláz-inhibitort adunk a 7. példában leírt minőségben, az alábbi táblázatban megadott adagolás sze-45 rint. A keményítő beadása után, a táblázatban megadott időközökben meghatározzuk a vér glükóz-tartalmát, a retroórbitális véna-plexus alapján, a Hoffman által (J. Biol. Chem. 120, 51, 1937) leírt módon önműködő „Technicon" elemzőkészülékkel. 50-Embereken az alimentáris hiperglikémia és hiperinzulinémia kiváltása céljából a kísérleti személyeknek (7—8 emberből álló csoportokban) 60 g (vízzel előzőleg felforralt) keményítőt adunk. A vér glükóz-szintjét 55 közvetlenül a kísérlet megkezdése előtt, majd ezt követően rövid időközökben, az utolsó ujjpercből vett kapilláris-vérmintában határozzuk meg a fent leírt módon. A kísérlet további folyamán a vizsgálandó hatóanyagnak a kísérleti eredményeket összefoglaló táblá-60; zatokban megadott mennyiségét adjuk a kísérleti személyeknek beadandó keményítő-szuszpenzióhoz. 4
