171216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szacharáz-inhibitorok előállítására
3 171216 4 tatjuk; AE a sorozatvizsgálat során a megmaradt amiláz-aktivitás mennyiségét jelenti. A fenti képlettel számolt százalékos gátlást több koncentrációnál megállapítjuk, a kapott görbéből leolvassuk az 50%-os gátlásnak megfelelő értéket és AIE/mg inhibitor egységre átszámítjuk. A szacharáz-gátló hatást a szacharáz-inhibitor-egységek (SIE) számával adhatjuk meg. Egy szacharáz-inhibitoregység olyan mennyiségű inhibitort jelent, amely két szácharáz-egyseget 50%-osan gátol. A szacharázegység (SE) a szacharáz olyan mennyisége, amely megadott vizsgálati feltételek között 1 perc alatt 1 fjunól szacharózt glükózzá és fruktózzá hasít. A keletkezett glükóz fjimóljait glükózoxidáz-reakció segítségével kvantitatíven olyan körülmények között határozzuk meg, amelyek között a szacharáz már nem hasítja a szacharózt. A vizsgálatot úgy valósítjuk meg, hogy 0,05 ml 0,12 SE aktivitásra beállított szacharáz-oldatot 0—20 y.g inhibitorral vagy 0—20 <xl vizsgálandó oldattal elegyítünk, és az elegyet 6,0 pH-jú 0,1 m nátriummaleinátoldattal 0,1 ml-re feltöltjük. [A szacharáz-oldatot például szolubilizált szacharázból, ezt pedig R. Borgström és A. Dahlquist eljárásával (Acta Chem. Scand. 12 1997, 1958) állíthatjuk elő. Az előállított szacharázt 6,0 pH-jú nátriummaleát-pufferrel hígítjuk a megfelelő aktivitásig]. Az elegyet 10 percen keresztül 35 C°-on tartjuk, majd 0,1 ml, 35 C°-ra előmelegített 0,05 m szacharóz-oldattal elegyítjük A szacharózoldatot 6,0 pH-jú 0,1 m nátriummaleát-pufferrel készítjük. Az elegyet 20 percen keresztül 35 C°-on inkubáljuk, majd a szacharáz-reakciót 1 ml glükózoxidázreagens hozzáadásával leállítjuk és az elegyet további 30 percen keresztül 35 C°-on inkubáljuk. Ezután 1 ml 50%-os kénsavat adunk az elegyhez és megfelelő összehasonlító oldat mellett 545 nm-nél mérjük az extinkciót. A szacharázinhibitor aktivitást úgy értékeljük ki, hogy glükóz kalibrációs görbe segítségével kiszámítjuk a különböző koncentrációknál mért százalékos szacharáz-gátlást, majd a kapott eredményeket SIE/g ill. SlE/liter egységekre számítjuk át. Az elemzésben szereplő glükózoxidáz-reagenst a következőképpen állítjuk elő: 2 mg glükózoxidázt (a Boehringer cég gyártmánya, N° 15423 EGAB) feloldunk 100 ml 7,0 pH-jú 0,565 m trisz. HCl-pufferben, majd az oldathoz hozzáadunk 1 ml detergensoldatot (2 g Triton X 100 +8 g 95%-os etanol p. a.), 1 ml dianizidin-oldatot (260 mg o-dianizidin. 2 HCl 20 ml vízben oldva), továbbá 0,5 ml 0,1 /o-os vizes peroxidáz-oldatot (a Boehringer-cég gyártmánya, N° 15302EPAP). Az amiláz-inhibitort a találmány szerinti eljárással úgy alakítjuk át szacharáz-inhibitorrá, hogy az inhibitormolekula enzimgátlás szempontjából inaktív molekularészeit (többnyire mono-, di- vagy triszacharidokat) lehasítjuk. A hidrolízis-jellegű hasítást enzimatikus vagy kémiai úton végezhetjük, előnyösen nagy hőmérsékleten végzett savas hidrolízist alkalmazunk. A hidrolízis céljából az említett nagyhatású amiláz-inhibitorok 0,1— 5 n, előnyösen 0,5—2 n ásványi savakban készített 1,40%-os, előnyösen 2—20%-os oldatát 0,1—6 órán, előnyösen 0,5—4 órán keresztül 60—110 C°-on, célszerűen 80—100 C°-on hidrolizáljuk. Ásványi savként célszerűen sósavat vagy kénsavat alkalmazunk. A hidrolízis során az amiláz-inhibitor aktivitás meredek csökkenése és ezzel egyidejűleg a szacharáz-inhibitor hatás meredek növekedése, majd — az eljárás végén — a szacháiázrinhibitor hatás enyhe csökkenése figyelhető meg. Az f = SIE/AIE, 103 hányados értéke a hidrolízisidő hosszabbodásával meredeken növekszik. Az 1. ábrán SE 50 törzs által előállított amilázinhibitor aktivitásváltozásait mutatjuk be a hidrolízis során. Az inhibitor 0,5 n sósavoldatban készített 2%-os oldatát 100 percen keresztül 100 C°-on kezeltük. Az ábrán a vízszintes tengelyen a percekben mért hidrolízisidőt tüntettük fel, az „1" függőleges tengelyen az amilázinhibitor aktivitást adtuk meg AIE.106 /liter egységekben a „2" függőleges tengelyen a szacharáz-inhibitor aktivitást tüntettük fel SIE.103 /liter egységekben. A nagy savkoncentráció, az oldat kis inhibitor-koncentrációja és a nagy hőmérsékletek hatására a fentiek szerint definiált „f" jellemző értéke különösen meredeken emelkedik, azaz a szacharáz-amiláz gátló hatás különösen gyorsan tolódik el a szacharáz-gátló hatás felé. Ez a 2. és a 3. ábrából is kitűnik: ezeken az ábrákon különböző hidrolízisfeltételek mellett feltüntettük a szacharáz-amiláz gátlási arányt az idő függvényében. Az ábrákon a vízszintes tengely a percekben megadott hidrolízisidőt, a függőleges tengely az „f" jellemző értékét adja meg. A 2. ábrán a 100 C°-on végzett hirdolizis lefutását tüntettük fel különböző amiláz-inhibitor és sósavkoncentráció mellett. görbe száma sósav töménysége, n amiláz-inhibitor koncentráció mg/mt i 1 20 2 í 200 3 0,75 20 4 0,75 200 5 0,5 20 6 0,5 200 A 3. ábrán a savkoncentráció és a hidrolízishőmérséklet 20 mg/ml koncentrációjú SE 50 amiláz-inhibitor SIE/AIE arányára gyakorolt befolyását adtuk meg. görbe sósav töménysége, n hidrolízis hőmérséklete C° í 2 90 " 2 2 80 3 1 90 4 1 80 5 0,5 90 6* 2 70 7 2 60 8 1 70 * Megjegyzés: a görbe kb. megegyezik a 0,5 n sósavkoncentráció mellett 80 C°-on felvett görbével. A hidrolizátumból a szacharáz-inhibitorokat úgy különítjük el, hogy a hidrolizátumot semlegesítjük, az inhibitorokat aktív szénen adszorbeáljuk, majd vizes alio 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
