170786. lajstromszámú szabadalom • Eljárás MM-13902 antibiotikum-sók előállítására
5 170786 6 stabilitásuk miatt a mono-sók csak nehezen állíthatók elő. Amint már korábban közöltük, a kromatográfiás elkülönítés során előnyösen az MM 13902 antibiotikum di-sóit tartalmazó elegyekből indulunk ki. Minthogy az MM 13902 antibiotikum sói vizes oldószer-rendszerekben jobban oldhatók, mint a nagymértékben lipofil oldószerekben, a kromatográfiás elválasztáshoz előnyösen vizes oldószer-rendszereket használunk fel. Poláros adszorbensek, például bázikus ioncserélő gyanták alkalmazása esetén eluálószerként előnyösen alkalmazhatjuk a pufferolt, lényegében semleges vizes elektrolit-oldatokat. Ha adszorbensként tercier aminocsoportokat vagy kvaterner ammónium-csoportokat hordozó ioncserélő gyantát használunk fel, eluálószerként igen előnyösen alkalmazhatunk valamely hagyományos pufferoldattal (például foszfátpufferrel) körülbelül 7-es pH-értékre pufferolt vizes nátriumklorid-oldatot. Adszorbensként igen előnyösen alkalmazhatunk bázikus cellulóz ioncserélő gyantákat; különösen előnyösnek bizonyult a QAE Sephadex A25 kereskedelmi nevű ioncserélő gyanta. Ez utóbbi gyanta esetén eluálószerként igen előnyösen alkalmazhatunk foszfátpufferrel pH = 7 értékre pufferolt 0,7 mólos vizes nátriumklorid-oldatot. Közömbös adszorbensek, például szilikagél vagy cellulóz alkalmazása esetén eluálószerként előnyösen víz és valamely vízzel elegyedő szerves oldószer (például rövidszénláncú alkanol) elegyeit használjuk fel. Cellulóz adszorbens alkalmazáskor különösen előnyös eluálószernek bizonyultak a víz: izopropanol elegyek, elsősorban a 7: 3 arányú izopropanol: víz elegy. Az ioncserélő gyanták alkalmazásával elkülönített termék rendszerint igen nagy mennyiségben tartalmaz nátriumkloridot, ezért az elkülönített eluátumfrakciókat célszerűen sómentesítésnek vetjük alá. A sómentesítést például úgy végezhetjük, hogy az oldatot olyan lipofil anyaggal töltött oszlopon bocsátjuk át, amely az MM 13902 antibiotikumot megköti, a nátriumkloridot azonban nem adszorbeálja. Lipofil adszorbensként például polisztirol-gyantákat, így Amberlite XAD 4 kereskedelmi nevű terméket használhatunk fel. A sómentesítést gélszűréssel is végrehajthatjuk; szűrőanyagként például térhálós dextrónokat, így Sephadex G 25-öt, valamint poliakrilamid-géleket, így Biogel P2-t alkalmazhatunk. Az antibiotikumot vízzel, vizes metanollal vagy hasonló oldószerekkel oldhatjuk le az oszlopról. Ezután a fenti módon kapott oldatból enyhe körülmények között eltávolítjuk az oldószert. Ekkor szilárd termékként kapjuk az MM 13902 antibiotikum di-sóját. Előnyösen úgy járunk el, hogy az oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk, illetve a megfelelő frakciókat fagyasztva szárítjuk. A fent ismertetett eljárást kívánt esetben két vagy több lépésben is végrehajthatjuk. Eljárhatunk például úgy, hogy az MM 4550 jelű komplex termék oldatából az első lépésben legföljebb 50% szennyezőanyagot és MM 13902 antibiotikumot (vagy az antibiotikum sóját) tartalmazó oldatot különítünk el, ezt az oldatot fagyasztva szárítjuk, majd a kapott — például 50—60% MM 13902 antibiotikumot vagy antibiotikum-sót tartalmazó — szilárd anyagot ismét kromatografáljuk. A második kromatográfiás lépésben például 90—100%os tisztasági fokú terméket állíthatunk elő. Az „MM 4550 jelű komplex termék" megjelölésen az 1 363 075 sz. brit szabadalmi leírás szerint előállított, és az idézett brit szabadalmi leírásban MM 4550 antibiotikumnak nevezett anyagot értjük. Az 1 363 075 sz. brit szabadalmi leírás példái szerint előállított MM 4550 jelű 5 komplex termék összetett anyag, amely változó mennyiségben tartalmaz MM 4550 antibiotikum-sót, MM 13902 antibiotikum-sót és egyéb kísérőanyagokat. Az MM 4550 jelű komplex termék ultraibolya spektruma nem egyezik meg az MM 13902 antibiotikum ultraibo-10 lya spektrumával. Az MM 4550 jelű komplex termék I50 -értéke általában 0,0004 [jig/ml-nél nagyobb. Az MM 4550 jelű komplex termékben jelenlévő MM 4550 antibiotikum-só és MM 13902 antibiotikum-só aránya a felhasznált mikroorganizmus-törzstől és/vagy az el-15 különítési módszerektől függően viszonylag széles határok között változik, azt tapasztaltuk azonban, hogy a komplex termék általában nagyobb részarányban tartalmazza az MM 4550 antibiotikumot, mint az MM 13902 antibiotikumot. Az MM 4550 jelű komplex ter-20 mék előállítását az 1—12. példában ismertetjük. Az „MM 4550 antibiotikum" megjelölésen egy lényegében tiszta, erős (3-laktamáz-inhibitor hatással és közepes antibakteriális aktivitással rendelkező vegyületet értünk. Az MM 4550 antibiotikum sajátságait az 1—12. 25 példában részletesen ismertetjük. Az MM 13902 antibiotikum sóinak előállításához kiindulási anyagként felhasznált komplex MM 4550 antibiotikumot úgy állíthatjuk elő, hogy valamely MM 13902 antibiotikumot és MM 4550 antibiotikumot ter-30 melő Streptomyces-törzset tenyésztünk, majd a tenyészetből elkülönítjük az MM 4550 antibiotikumot. A tenyésztési eljárásban Streptomyces-törzsként különösen előnyösen alkalmazhatjuk az ATCC 21379, 21380, 21381, 21382 és 31126 letéti számú Streptomyces 35 olivaceus-törzseket, illetve e törzsek mutánsait. A legelőnyösebb komplex antibiotikum-termelő törzsnek a Streptomyces olivaceus ATCC 31126 törzs bizonyult. A leírásban a „tenyésztés" megjelölésen azt értjük, 40 hogy a mikroorganizmust assziminálható szén-, nitrogén-, kén- és ásványi só-forrás jelenlétében, aerob körülmények között növekedni hagyjuk. A mikroorganizmust szilárd vagy félig szilárd táptalajon, illetve a táp^anyagokat oldott vagy szuszpendált állapotban tartal-45 mázó folyékony közegekben egyaránt tenyészthetjük. A tenyésztést felületi vagy szubmerz tenyészetben egyaránt végrehajthatjuk. A tápanyag kémiailag jól definiált anyagok elegye lehet, azonban komplex táptalajokat is felhasználhatunk. Különösen előnyösnek találtuk a 50 komplex tápanyagokat, így élesztőkivonatot, szójabablisztet és hasonlókat tartalmazó táptalajok alkalmazását. Azt tapasztaltuk továbbá, hogy a fermentációt igen előnyösen befolyásolja a kobalt- és szulfát-ionok, va!ä L mint a kalciumkarbonát jelenléte. 55 Azt tapasztaltuk, hogy ha a tenyésztést 28 ±2 C°-on végezzük, az antibiotikum megfelelő hozammal képződik. A fermentlevet előnyösen a fermentáció beindítása után 2—3 nappal különítjük el. A „mutáns" megjelölésen az alaptörzsből spontán 60 mutációval vagy külső mutagen szer hatására kialakuló törzseket értjük. A mutáns törzsek kialakításának módszereit többek között H. I. Adler ismerteti (Techniques for the Development of Micro-organisms, „Radiation and Radioisotopes for Industrial Micro-organisms", az 65 International Atomic Energy Authority által tartott 3
