170670. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típúsú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
9 170670 10 5.2 g (75,5%) (Id) képletű vegyületet kapunk. A termék vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: P2, illetve D elegy) egységes. Op.: 236—237 C°, (<x)£ = -23,0° (c = 1, dimetilformamidban). 2. Kiindulási anyagként 5,7 g (10 mmól) (le) képletű vegyületet és 2,46 g (15 mmól) p-nitro-fenil-izocianátot használunk fel. A reakciót az 1. példa a—1. lépésében leírt módon végezzük. A terméket metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 5.3 g (75,5%) (If) képletű vegyületet kapunk. A termék vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: P2, illetve D elegy) egységes. Op.: 235—237 C°, («)p = = —22,5° (c = 1, dimetilformamidban). g) lépés: N«-Bz-Phe-Val-Arg-pNA • HCl (I) Sakakibara-készülék [Bull. Chem. Soc. Japán 20, 2164 (1967)] reakcióedényébe 345 mg (0,5 mmól) (If) képletű vegyületet helyezünk, és a reakcióedénybe 5 ml vízmentes hidrogénfluoridot kondenzálunk. Az elegyet 1 órán át 0 C°-on keverjük, ekkor a guanidin-csoport nitro-védőcsoportja lehasad. Ezután a hidrogénfluoridot vákuumban lepároljuk, és a száraz maradékot dimetilformamidban oldjuk. A peptid hidrogénfluoridját tartalmazó dimetilformamidos oldathoz 0,25 ml tömény sósavoldatot adunk, és az elegyet vákuumban szárazra pároljuk. Ezt az eljárást megismételjük. A maradékot 33%-os ecetsavban oldjuk. Az oldatot 33%-os ecetsavval egyensúlyba hozott Sephadex G—15 gélen szűrjük, majd az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 275 mg (80,7%) amorf, porszerű (I) képletű vegyületet kapunk, amelynek Cl-tartalma 5,12%. A termék vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [a]2f = -43,5° (c =0,69, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; Phe: 1,2; Arg: 0,99. 2. példa Na -3-feml-propionil-Phe-Val-Arg-pNA • HCl (II) a) lépés: Na -3-fenil-propionil-Phe-Val-Arg(N0 2 )-OMe (Ha) Kiindulási anyagként 30,7 g (50 mmól) Cbo-Phe-Val-Arg(N02)-OMe-t és 16,3 g (60 mmól) 3-fenil-propionil-OpNP-t használunk fel. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 25,5 g (82,5%) (IIa) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj, illetve C elegy) egységes. b) lépés: N*-3-fenil-propionil-Phe-Val-Arg(N02 )-OH (IIb) Kiindulási anyagként 7,1 g (11,5 mmól) (Ha) képletű vegyületet használunk fel. A reakciót az 1. példa e) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen tisztítjuk. 6,5 g (93,7%) (IIb) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A, illetve C elegy) egységes. Mólsúly 584,1; [a]£= -9,3° (c = l,0, metanolban). 5 c) lépés: Na -3-fenil-propionil-Phe-Val-Arg(N02)-pNA (He) Kiindulási anyagként 3 g (5 mmól) (IIb) képletű vegyületet és 1,23 g (7,5 mmól) p-nitro-fenil-izocianátot 10 használunk fel. A reakciót az 1. példa a—1) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 2,65 g (66,3%) (IIc) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: P, elegy) 15 egységes. d) lépés: N*-3-fenil-propionil-Phe-Val-Arg-pNA • HCl (ID 20 Kiindulási anyagként 179 mg (0,25 mmól) (IIc) képletű vegyületet használunk fel. A reakciót az 1. példa g) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 33%os ecetsavval egyensúlyba hozott Sephadex G—15 gélen 25 tisztítjuk, és az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 45 mg (26,5%) amorf, porszerű, 4,91% klórtartalmú (II) képletű vegyületet kapunk. A termék vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [a]f? = = —36,7° (c=0,71, 50%-os ecetsavban.) Aminosav-30 elemzés eredménye: Val: 1,0; Phe: 1,1, Arg: 0,99. 3. példa 35 H-Phe-Val-Arg-pNA • 2 HCl (III) Kiindulási anyagként 198 mg (0,28 mmól) (Ic) képletű vegyületet használunk fel. A reakciót az 1. példa g) 40 lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 50%-os ecetsavval egyensúlyba hozott Sephadex G—25 gélen szűrjük. Az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 170 mg (61,0%) amorf, porszerű, 11,37% klórtartalmú (III) képletű vegyületet kapunk. A termék vékonyréteg-45 kromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. MD = —26,3° (c=0,61, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; Phe: 0,95; Arg: 1,0. 4. példa H-Phe-Phe-Val-Arg-pNA • 2 HCl (IV) 55 a) lépés: Cbo-Phe-Phe-Val-ArgíNO^-pNA (IVa) Kiindulási anyagként 335 mg (0,46 mmól) (Ic) képletű vegyületet és 317 mg (0,75 mmól) Cbo-Phe-OpNP-t használunk fel. A reakciót az 1. példa b) 60 lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket dimetilformamidban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 282 mg (70,0%) (IVa) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes. Op.: 201—204 C°, [afe5 = -1,02° (c=0,98, 65 dimetilformamidban). 5
