170669. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
9 170669 10 Kiindulási anyagként 243 mg (0,335 mmól) (Illb) képletű vegyületet és 93 mg (0,41 mmól) Bz2 0-t használunk. A reakciót a 2. példa a) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 147 mg (63%) (IVa) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes. Op.: 148—152 °C, [a]g!= -6,33° (c=0,84, dimetilformamidban). b) lépés: N-Bz-ß-ciklohexil-Ala-Val-Arg-pNA • HCl (IV) Kiindulási anyagként 106,0 mg (0,152 mmól) (IVa) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példa d) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 20%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. Az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 86,7 mg (84%) amorf, 5,10% klórtartalmú (IV) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [aß3 = -77° (c = 0,3, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; ß-ciklohexil-Ala: 1,2; Arg: 1,0. 5. példa N-Bz-N-ciklohexil-ß-Ala-Val-Arg-pNA. HCl (V) a) lépés: N-Cbo-N-ciklohexil-ß-Ala-Val-Arg(N02)-pNA (Va) Kiindulási anyagként 286 mg (0,5 mmól) (Illa) képletű vegyületet és 300 mg (0,7 mmól) N-Cbo-N-ciklohexil-ß-Ala-OpNP-t használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 313 mg (86%) amorf (Va) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pt elegy) egységes. [OC]D = ±0° (c = 1,0, dimetilformamidban). b) lépés: N-Bz-N-ciklohexil-ß-Ala-Val-Arg(N02)-pNA (Vb) Kiindulási anyagként 300 mg (0,413 mmól) (Va) képletű vegyületet és 123 mg (0,544 mmól) Bz2 0-t használunk. A reakciót a 2. példa a) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 243,5 mg (87%) amorf (Vb) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes, [a]" = + 0,5° (c = 0,43, dimetilformamidban). c) lépés: N-Bz-N-ciklohexil-ß-Ala-Val-Arg-pNA.HCl (V) Kiindulási anyagként 170 mg (0,242 mmól) (Vb) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példa d) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. Az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 126 mg (76%) amorf, 5,11% klórtartalmú (V) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [a£3 = -38,5° (c=0,69, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; N-ciklohexil-ß-Ala: 1,3; Arg: 0,9. 6. példa N-Bz-Val-Val-Arg-pNA. HCl (VI) 5 a) lépés: Cbo-Val-Val-Arg(N0 2)-pNA (Via) Kiindulási anyagként 1,97 g (3,43 mmól) (Illa) képletű vegyületet és 1,6 g (4,2 mmól) Cbo-Val-OpNP-t használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex 10 LH—20 gélen szűrjük 1,9 g (82%) amorf (Via) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: PL, illetve C elegy) egységes. b) lépés: N-Bz-Val-Val-Arg(N02)-pNA (VIb) 15 Kiindulási anyagként 1,9 g (2,83 mmól) (Via) képletű vegyületet és 0,77 g (3,40 mmól) Bz2 0-t használunk. A reakciót a 2. példa a) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 1,45 g (80%) amorf (VIb) képletű vegyületet 20 kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes. MD = +5,6° (c = l,01, dimetilformamidban). c) lépés: N-Bz-Val-Val-Arg-pNH.HCl (VI) 25 Kiindulási anyagként 362 mg (0,564 mmól) (VIb) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példa d) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 33%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. Az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 248 mg (69,7%) 30 amorf, 5,54% klórtartalmú (VI) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [a]% = - 57,0° (c =0,65, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 2,0; Arg: 0,9. 7. példa N-Bz-Leu-Val-Arg-pNA. HCl (VII) 40 a) lépés: Cbo-Leu-Val-Arg(N02)-pNA (Vila) Kiindulási anyagként 1,97 g (3,43 mmól) (Illa) képletű vegyületet és 1,7 g (4,2 mmól) Cbo-Leu-OpNP-t használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt 45 módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük 2,05 g (87%) amorf (Vila) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pt, illetve C elegy) egységes. 50 b) lépés: N-Bz-Leu-Val-Arg(N02 )-pNA (Vllb) 1,75 g (2,55 mmól) (Vila) képletű vegyületből és 695 mg (3,06 mmól) Bz20-ból indulunk ki. A reakciót a 2. példa a) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 55 1,49 g (91%) amorf (Vllb) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes. [«]" = +2,4° (c = l,01, dimetilformamidban). 60 c) lépés: N-Bz-Leu-Val-pNA. HCl (VII) Kiindulási anyagként 319 mg (0,486 mmól) (Vllb) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példa d) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 33%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. 65 Az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 276 mg (88%) amorf, 5
