170665. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminocukor származékok tiszta állapotban való elkülönítésére keverékeikből
29 170665 30 (72 000 SIE/liter) 30 percen át keverjük 2 g Amberlite IRC 50 H+ és 1 g Amberlite IRA 410 OH~ ioncserélővel, így kisózzuk (vezetőképesség kisebb, mint 2 m Siemens). Ezután leszűrjük, és a szűrletet 5 ml/óra sebességgel átfolyatjuk Dowex H+ ioncserélővel 0,001 n sósavban egyensúlyban tartott oszlopon (átmérője 1 cm X10 cm). Ezután 200 ml 0,001 n sósavval utánamossuk. Deszorpció céljából 0,6%-os ammónia-oldatot viszünk keresztül az oszlopon 10 ml/óra sebességgel, és 5 ml-es frakciókat veszünk el. A szacharázgátló aktivitást mutató frakciókat egyesítjük, rotációs bepárlóban 2 ml térfogatra bepároljuk, és 2 ml metanollal összekeverjük. A kapott oldat pH-ját 3—4-re beállítjuk, és 100 ml acetonba csepegtetve a terméket kicsapjuk. A csapadékot szűrjük, acetonnal és éterrel mossuk, és vákuumban megszárítjuk. Hozam: 26 mg, aktivitása 28 000 SIE/g; a termék olyan aminocukor-származékokból áll, amelyekben nx + n 2 = 2 vagy 3. Ebből a termékből az olyan tiszta aminocukor-származékot, amelyben nx + n 2 = 2, a 9. példa szerinti módon nyerjük ki gélszűréssel Bio—Gel P—2 oszlopon. így 7 mg olyan aminocukor-származékot kapunk, amelyben nx + n 2 = = 2, és aktivitása 60 000 SIE/g. 16. példa 2 liter tenyészszűrletet, amelyet a 6. példa szerinti módon kaptunk a micélium 13 000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással történő eltávolításakor és amelynek aktivitása 13 000 SIE/g, a sótartalom csökkentése céljából (a tenyészszűrlet vezetőképessége körülbelül 10 mS) 1 órán át keverünk 500 g olyan ioncserélő eleggyel, amely 2,5 rész Amberlite IRC 50 (H+-alak) és 1 rész Amberlite IRA 410 (OH~-alak) ioncserélőből áll. Ezután az ioncserélőt elválasztjuk, az oldatot körülbelül 100 ml alatti térfogatra bepároljuk, és az oldhatatlan alkotórészek eltávolítása céljából 15 percen át centrifugáljuk 20 000 fordulat/perc sebességgel. A felső réteget 100 ml térfogatra feltöltjük (vezetőképessége 3,5 mS) és további tisztítás céljából P-cellulózt (Serva Nr. 45 130; ismert módon előkészítve és 5 mM ammónium-pufferben, pH = 5,5, kiegyensúlyozva) tartalmazó oszlopra (55 X400 mm) visszük fel. Futtatószerként a megadott foszfát-puffért használjuk, a kifolyási sebesség 90 ml/óra, és 18 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk össze. Miután megvizsgáltuk az eluátum frakciók szénhidrát (antron-próba) és szacharázt gátló komponens tartalmát (szacharázt gátló próba), egyesítjük azokat a frakciókat, amelyek az antron-próba szerint szénhidrátoktól csaknem mentesek és ugyanakkor á szacharázt gátló próbában különösen hatékonynak bizonyulnak (60— 170. frakciók), 150 ml térfogatra bepároljuk, és Amberlite IRA 410 (HC03 ~-alak) ioncserélővel töltött oszlopon (50 X 300 mm) szűrjük. Az ionmentesítés jobb 55 ellenőrzése céljából az eluátumot frakciókban fogjuk fel (frakciónként 10 ml 20 perc alatt) és megvizsgáljuk azok szénhidrát (antron-próbával, végig csaknem negatív), foszfát (aszkorbinsav-molibdát reagenssel, végig negatív) és szacharáz gátló inhibitor tartalmát (enzimgátló 60 próbával). A gátló hatású frakciókat (3—30.) egyesítjük, bepároljuk és liofilizáljuk, újra feloldjuk és liofilizáljuk, hogy 280 mg nyers inhibitort kapjunk. További tisztítás céljából a nyers inhibitort a 6. példa szerinti módon Bio—Gel P—2 gélen frakcionáljuk. 65 Azokból a frakciókból, amelyek tiszta olyan aminocukor-származékot tartalmaznak, amelyben nx 4- n2 = 1, liofilizálás után 30 mg terméket különítünk el, amelynek aktivitása 0,3 X 106 AIE/g és 35 000 SIE/g. 17. példa Az olyan aminocukor-származékok kinyerése céljá-10 ból, amelyekben n1 +n 2 =5—7, például az 1. példa szerinti módon készített készítményekből indulunk ki. 30 g 1. példa szerinti készítményt feloldunk 250 ml vízben. Ennek az oldatnak a vezetőképessége 10 mS, pH-ja 5,5. Sómentesítés céljából az oldatot összekever-15 jük 60 g Amberlite IRC 50 H+ (gyengén savas kationcserélő, amely az aminocukor-származékokat vizes oldatból csak nyomokban köti meg) és 20 g Amberlite IRA 410 OH^ ioncserélővel, és 20 percen át keverjük. A szűrlet (vezetőképesség 0,5 mS, pH = 3,5) pH-ját n 10 sósavval 3,0-ra állítjuk be (vezetőképesség 0,6 mS). Ezt az oldatot 42 ml/óra sebességgel visszük át Dowex 50 W 4 (200—400 mesh, H+) ioncserélővel töltött oszlopon (átmérő 2,5 cm, magassága 40 cm, 0,001 n sósavban kiegyensúlyozva), majd 2 liter 0,001 n sósavval utána-15 mossuk. Az oszlop kimosása után 1,2%-os vizes ammónia-oldattal eluáljuk, és 10 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk össze. A gátló hatású frakciókat összegyűjtjük, egyesítjük, az ammóniát vákuumban ledesztilláljuk, és ezután az oldatot vákuumban 30 ml térfogatra bepárol-50 juk. A terméket 600 ml száraz alkoholba végzett becsepegtetéssel lecsapjuk, a csapadékot leszűrjük, és alkohollal és éterrel végzett mosás után vákuumban szárítjuk. Hozam: 4,4 g, aktivitása 26,5 X106 AIE/g. További tisztítás céljából az anyag 0,5 g-ját preparatív 15 Bio—Gel P—2 oszlopra visszük fel a 9. példa szerinti módon és kifejlesztjük. Azokat a frakciókat, amelyek vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatok szerint (amiláz inhibitor által okozott elszíneződés) olyan aminocukorszármazékokat tartalmaznak, amelyekben nx + n 2 = 10 5—7, egyesítjük, vákuumban bepároljuk és a fentiekben leírt módon száraz alkohollal lecsapjuk. Hozam 0,5 g nyers termékből: 0,2 g olyan aminocukor-származékok, amelyekben n1 +n 2 = 5—7, aktivitás 30 X 106 AIE/g és 2500 SIE/g. 18. példa I. glükozidhidroláz-inhibitorok hatékonyságának és a glükózreszorpció gátlásának vizsgálata patkányon és emberen. Táplálkozási hiperglikémia és hiperinzulinémia előállítása céljából 6 darab éheztetett patkánynak, illetve kiéheztetett kísérleti személynek perorálisan vizes oldat vagy szuszpenzió alakjában 2,5 g szacharózt vagy 2,5 g maltózt vagy 1 g főzött keményítőt vagy 2,5 g glükózt adunk be kg-ként, illetve személyenként 50 g szacharózt vagy 50 g maltózt vagy 50 g főzött keményítőt vagy 50 g glükózt. 6 másik patkánynak ugyanolyan mennyiségű megadott szénhidrátot és azon kívül a példákban megnevezett hatóanyagok egyikét is beadjuk a megadott adagban. Egészséges kísérleti személyeknek 2 naponként beadjuk a felsorolt szénhidrátok egyikét felváltva egyszer vagy a megadott hatóanyagok egyikével, illetve anélkül. A vércukrot és a széruminzulint a szénhidrát 15
