170618. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a Marek-féle betegség elleni vakcína előállítására
3 170618 4 1258-1259., Rispens et al.: British Veterinary Journal, 1969, 125, 445-453.). Ezek a vakcinák jó védelmet biztosítottak, de csak meglehetősen költséges módon lehetett őket tárolni és felhasználni, mert a vírus csak élő sejtekhez kötött 5 állapotban volt ezekben a vakcinákban életben tartható. Witter és munkatársai 1969-ben (Witter R. L. et al: American Journal of Veterinary Research, 1969, 31, 525-538. és 162 835 számú magyar szabadalmi leírás) pulykából izoláltak egy io herpesz típusú vírust, amely jó védelmet adott az MB ellen. Calnek és munkatársainak sikerült (CalnekB. et al.: Applied Microbiology, 1970, 20, 723-726.) ezt a pulyka herpesz vírust sejtmentesen is kinyerni és liofilezni, ami a vakcina 15 előállítását és tárolását lényegesen megkönnyíti (2 158 293 számú NSZK-beli közrebocsátási irat). A Marek-féle betegség elleni vakcinák védőhatása, mai ismereteink szerint, jórészt azon alap- 20 szik, hogy a szervezetbe bevitt vakcina-törzs elszaporodik, majd tartósan magas titerben megmarad a szervezetben és így megakadályozza a virulens MB vírus nagymértékű elszaporodását és ennek következtében onkogen hatásának érvényesülését a vak- 25 cinázott állatban. A baromfi környezetében ugyanis az MB vírusának háromféle virulenciájú változata fordul elő: virulens, mérsékelt virulenciájú és avirulens. Ezek az MB vírusok a vakcinázott állat szervezetében meg tudnak telepedni, de ha a 30 vakcina-vírus már kellőképpen elszaporodott és elég magas koncentrációban van jelen, akkor nem tudnak nagyobb mértékben elszaporodni és megbetegíteni az állatot. 35 Az Amerikai Egyesült Államokban izolált FC 126 jelű pulyka-herpesz vírussal lényegesen sikerült ugyan az MB okozta veszteségeket csökkenteni, de az állományokban néhány (1—5%-os) %-os sőt esetenként ennél nagyobb veszteség álta- 40 Iában még így is előfordul. Saját vizsgálataink szerint a világszerte használt FC 126 törzs a naposcsibék szervezetében aránylag lassan és egyenetlenül szaporodik el. 45 Kísérleteink során pulykából izoláltunk egy élő, nem patogén, A-antigénnel rendelkező törzset, amely különböző szövettenyészetekben jól elszaporítható, és amely hatékony védelemmel ruházza fel a fertőzésnek kitett csirkéket. Ez az általunk 50 izolált törzs, az 1RS jelzésű törzs, lényegesen gyorsabban szaporodik el és magasabb titerben marad meg az állatok szervezetében. A pulyka-herpesz vírus használatával kapcsolatban ugyanis már több közlemény foglalkozott azzal, hogy az 55 ilyen vakcinával oltott tojók e vírus elleni ellenanyagot tartalmazó tojásokat tojnak. Az ezekből kikelő csibék, szikimmunitásuk következtében, néhány hétig bizonyos fokú gátló hatást gyakorolnak a pulyka-herpesz vírusra. Az általunk izolált törzs, 60 úgy tűnik, kevésbé érzékeny e gátló hatás iránt. A találmány értelmében úgy állítunk elő élő 1RS pulyka-herpesz vírus törzset tartalmazó sejthez kötött vagy sejtmentes vírusvakcinát, hogy az 65 Országos Közegészségügyi Intézetben 1974. február 7-én 00123 szám alatt letétbe helyezett pulyka-herpesz vírus törzzsel csirkeveséből, csirkeembrió-fibroblasztból vagy kacsaembrió-fibroblasztból származó szövettenyészetet beoltunk, a beoltott tenyészetet inkubáljuk, majd a sejteket elkülönítjük az inkubált tenyészetből és friss tenyészetre helyezzük és így sorozatos sejttenyésztést végzünk, majd a) élő, legyengítetlen sejthez kötött vírusvakcina előállítása esetén a tenyésztés utolsó szakaszában a sejteket tripszinnel kezeljük, majd a sejteket elválasztjuk a tripszines közegtől és dimetilszulfoxidot vagy glicerint tartalmazó tenyésztési közegben szuszpendáljuk és fagyasztjuk, vagy b) élő, legyengítetlen, sejtmentes vírusvakcina előállítása esetén a tenyésztés utolsó szakaszában a sejteket tripszinnel kezeljük, ezután a sejteket a tripszines közegtől elválasztjuk, elroncsoljuk, az elroncsolt sejteket eltávolítjuk, majd kívánt esetben a kapott vakcinát fagyasztjuk, vagy fagyasztva szárítjuk. A fenti módon előállított vakcinával oltott, az MB iránt genetikailag nagyon fogékony csirkék nem betegedtek meg. A vakcinával oltott naposcsibék a vadvírus megbetegítő képességével szemben ellenállónak bizonyultak. A találmány szerinti eljárást az alábbiakban részletesen ismertetjük. A vakcina előállításához felhasznált pulyka-herpesz vírust 10-12 hetes egészséges pulykák véréből izoláltuk. Az izolátum által szövettenyészetben termelt A-antigén nem adott precipitációs vonalat a különböző Marek-féle betegség herpesz vírusai (MBHV) ellen termelt csirkesavókkal agar-gél precipitációs próbában. Megfordítva: az 1RS ellen termelődött keringő ellenanyagok precipitációs vonalat adnak az MBHV-k által szövettenyészetben termelődött A-antigénnel és a homológ 1RS A-antigénnel. Az izolátum magas dózisával oltott napospulykák, és genetikailag nagyon fogékony vörös izlandi (Vi) csirkék a kísérleti periódus alatt mindvégig egészségesek maradtak. Az izolátumokat vérsejt, illetve vesesejt szuszpenzióból indítottuk. A közvetlen vesetenyésztési mód esetében a vesesejteket tripszint és etiléndiamintetraecetsav-dinátrium sóját tartalmazó fiziológiás sóoldattal diszpergáltuk, majd ismételt mosás után tenyésztő edényekbe mértük. A vérsejteket és az előbb említett módon nyert vesesejt szuszpenziót többször mostuk fiziológiás sóoldatban, majd 4-24 órás csirkevese (CSVH), csirkeembrió fibroblaszt (CSEF), vagy kacsaembrió fibroblaszt (KEF) szövettenyészetekhez adtuk. A tenyészeteket 37C°-on 5% C02 -t tartalmazó légtérben magas páratartalom mellett inkubáltuk és szükség szerint cseréltük a tápfolyadékot. A te-2
