170534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2- amino- 4-hidroxi- 7,8- dihidro-pteridin vegyületeket tartalmazó antimikróbás hatású szinergetikus szerek előállítására

39 170534 40 13. táblázat Hatóanyag, mg/egér Nulla Túlélés DMHP mg/egér Túlélés 2 mg p.o. 2 mg: Túlélés Lp. Szulfa-Piriátlagideje, Túlélők átlaideje Túlélők átlagideje, Túlélők metoxazol metamin nap % nap % nap % 0,8 >15,33 33,3 >17,83 50 4,0 0 0,4 >18,83 33,3 >17,0 33,3 >12,0 0 0,2 10,16 0 9,16 0 8,66 0 0,1 8,16 0 7,83 0 6,16 0 1 0,4 >19,33 16,6 >24,5 66,6 >21,16 50 1 0,2 >19,33 33,3 >18,5 33,3 >11,16 16,6 1 0,1 11,0 0 >15,16 16,6 12,5 0 1 0,05 >12,83 16,6 10,83 0 10,16 0 Kezeletlen egér 6,5 0 7,0 0 6,33 0 20 19. példa Ebben a példában olyan kísérleteink eredményeit mutatjuk be, melyekkel az I általános 25 képletű 2-amino-4-hidroxi-7,8-dihidro-pteridin-származékoknak a találmány szerinti gyógyászati készítmények másik két komponensére kifejtett szinergetikus hatását kívánjuk igazolni. E célból előzetesen megvizsgáljuk egy p-aminobenzoesav kom- 30 petitor, és pedig a szulfakinoxalin, valamint egy dihidrofolát-reduktáz inhibitor, és pedig a diaveridin minimális antikokcidiális aktív koncentrációját. E vizsgálatnál az alábbiak szerint járunk el. Csirkeembrió májsejtek primer kultúráját ráolt- 35 juk lapos fenekű üregeket tartalmazó mikrotitráló lemezekre oly módon, hogy minden üregbe 75 mikroliter szövetkultura szuszpenziót töltünk. Ezután a vizsgált vegyület szuszpenzióját adjuk a szövettenyészethez, és e rendszert 25 mikroliteres 40 Linbro hígítóval hígítjuk. Ezután rögtön újabb 50 mikroliter szövetkultura szuszpenziót adunk a rendszerhez, a lemezeket lezárjuk és 41 C°-on inkubáljuk egy széndioxiddal töltött inkubátorban. 24 óra múlva Eimeria tenella mikroorganizmus Weybridge 45 törzsének spóratokból frissen kipreparált spóráiból készített 2 • 10

s spóra/ml koncentrációjú 25 mikroliter szuszpenzióját (Oxford minta) töltjük valamennyi üregbe. A lemezeket újra lezárjuk és 96 órán át inkubáljuk. Ezután a kultúrákat rög- 50 zítjük és 0,1%-os toluidinkék-oldattal megcseppentjük. A mikrotitráló lemez lehetőséget nyújt arra, hogy számos hígítást végezzünk, így könnyen megállapítható a minimális aktív koncentráció. Vizsgálataink során az alábbi eredményeket kapjuk: 55 Vegyület Minimális aktív koncentráció a mikrotitráló lemezeken (jug/ml) Szulfakinoxalin Diaveridin 0,024 0,098 60 65 Kísérleteink szerint tehát a szulfakinoxalin antikokcidiális hatás kifejtéséhez szükséges minimális koncentrációja 0,024 jug/ml, a diaveridiné pedig 0,098 /Líg/ml. A továbbiakban megvizsgáljuk a szulfakinoxalin és a diaveridin pteridin-származékkal készített kombinációinak aktivitását. A szinergetikus hatás kontrolljaként megvizsgáljuk a kombinációba bevont pteridin vegyületek hatását önmagukban is. 5 mg pteridint 0,05 ml etanolban szuszpendálunk, és a szuszpenzióhoz 0,95 ml steril desztillált vizet adunk. A tápoldattal további hígításokat készítünk aszeptikus körülmények között. Lúgos, illetve savas szulfakinoxalin és diaveridin oldatokat készítünk, és az oldatokat Millipore szűrőn szűrjük. Csirkeembrió-máj sejtek egyrétegű kultúráját Eimeria tenella Weybridge mikroorganizmus törzszsel megfertőzzük, és a kultúrát mikrotitráló edényekben változó koncentrációjú, önmagában vett illetve 0,01/ig/ml szulfakinoxalinnal és 0,03125 Mg/ml diaveridinnel kombinált pteridinnel kezeljük. A kapott eredményeket az alábbi pontszámokkal jelöljük. A paraziták fejlődésének teljes elmaradása A kontrolihoz képest 1—25% parazita fejlődés A kontrollhoz képest 26-50% parazita fejlődés A kontrolihoz képest 51—75% parazita fejlődés A kontrollhoz képest 76-95% parazita fejlődés A kontrollhoz képest 95-100% parazita fejlődés 5 4 3 2 1 0 A fenti pontszámokkal kiértékelt eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze: 20