170522. lajstromszámú szabadalom • Eljárás élő legyengített influenza-vírustörzsek és ezeket tartalmazó vírus-vakcinák előállítására
13 170522 14 6. példa A 3. példában leírt módon előállított, fagyasztva szárított anyagot (azaz az R 5 törzset (ATCC VR787) használjuk fel kiindulási anyagként a nagyüzemi vakcinatermeléshez. A fagyasztva szárított törzset embriót tartalmazó tyúktojások allantoisz-folyadékában egy lépésben tenyésztjük. A tojásokat 3 napon át 35 Cc-on inkubáljuk. Az allantoisz-folyadékokat elkülönítjük, egyesítjük, megvizsgáljuk sterilitásukat és biztonságukat, majd 5% peptonkoncentráció eléréséig peptonnal elegyítjük. A kapott elegyet 3 ml-es üvegfiolákba osztjuk szét, így egy-egy dózisegységnek megfelelő (azaz legalább 107 EID S0 mennyiségű) víruskészítményt kapunk. A terméket ezután fagyasztva szárítjuk, és a fiolákat leforrasztjuk vagy szorosan ledugaszoljuk. Az így kapott anyagot használjuk fel vakcina-alapanyagként. A vakcina beadása előtt egy fiola tartalmához 0,5 ml vizet, fiziológiás nátriumklorid-oldatot vagy 5%-os vizes szacharóz-oldatot adunk, és a kapott folyadékot az orrüregbe cseppentjük. A peptonnal elegyített allantoisz-folyadékot nagyobb fiolákba is szétoszthatjuk, és így több dózisegységet tartalmazó készítményeket állíthatunk elő. 7. példa A 4, példában leírt módon előállított, egy dózisegységnyi, fagyasztva szárított B-típusú influenza vírus-vakcinához [Brigit törzs (ATCC VR786)} egy dózisegységnyi élő, legyengített A-típusú influenza vírus [Alice törzs (ATCC VR776)] 0,5 ml 5%-os vizes szacharóz-oldattal készített szuszpenzióját adjuk. Az így kapott, két hatóanyagkomponensű vakcinát cseppek formájában adjuk be az orrüregbe, és a kezelést 14 nap elteltével megismételjük. A klinikai kísérletekhez 22 önként jelentkező, A- vagy B-típusú influenza-vírussal szemben kezelés előtt 64-es vagy annál kisebb Hl (hemagglutináció-gátló) faktorral rendelkező egyént választottunk ki. A kísérleti személyeknek 8-14 napos időközökben két dózisban orron át 107 » 5 EID 50 egységnek megfelelő mennyiségű Brigit-törzset és 107 > s EID S0 egységnek megfelelő mennyiségű Alice törzset adtunk be. A vizsgált esetek 80%-ában észleltünk A-típusú influenza vírussal szembeni, és 73%-ában észleltünk B-típusú influenza vírussal szembeni szérumkonverziót. Csak enyhe klinikai reakciókat észleltünk. A vakcina alapját képező vírusokat a kezelt egyének nem adták át. 8. példa Az 5. példában leírt módon előállított, egy dózisegységnyi (107,S EID SO ) fagyasztva szárított, B-típusú influenza vírus-vakcinához (R 22 törzs (ATCCVR788) egy dózisegységnyi (107,s EID 50 ) élő, legyengített A-típusú influenza-vírustörzs (Alice törzs, ATCC VR776) 0,5 ml 5%-os vizes szacharóz-oldattal készített szuszpenzióját adjuk. Az így kapott, két hatóanyagkomponensű vakcinát cseppek formájában adtuk az orrüregbe, és a kezelést 14 nap elteltével megismételtük. A második vakcinás kezelést követő 16. napon mind a két 5 komponensre vonatkozólag szérum-konverziót észleltünk. 10 9. példa B-típusú B/HK/5/72 influenza-vírustörzs (ATCCVR791, a törzs hemagglutininje eltér a Brigit törzs hemagglutininjétől) mintáját 10—11 napos, !5 embriót tartalmazó tyúktojások allantoisz-üregébe fecskendezzük. Minden egyes tojásba 0,2 ml vírusanyagot fecskendezünk. Nagymennyiségű vírus termelése céljából a kiindulási vírusanyagot három lépésben tenyésztjük. A harmadik tenyésztési lépés 20 után 10 8 EIDso/ml faktórú vírus-szuszpenziót kapunk. Az így kapott szuszpenzió 0,2 ml-es hígítatlan mintáit embriót tartalmazó SPF tojások allantoisz-üregébe fecskendezzük, és a rendszert 2 órán át 33 C°-on inkubáljuk. Ezután a tojások allan-25 toisz-üregébe az 1. példa szerint előállított, 107,s EIDso/ml faktorú Brigit törzs szuszpenziójának 0,2 ml-es mintáit fecskendezzük. A tojásokat 16 órán át 33°-on inkubáljuk, majd az allantoisz-folyadékot elkülönítjük. 30 0,25 ml, előzetesen 1 órán át 56 C°-on hőkezelt anti-Brigit törzs szérumtípusú nyúlszérumot azonos térfogatú normál szérummal elegyítünk. A kapott 35 szérum-elegy 0,25 ml-es mintáját az elkülönített allantoisz-folyadékhoz adjuk. Az elegyet 1 órán át 37 C°-on tartjuk, majd az elegy 0,2 ml-es mintáit embriót tartalmazó SPF-tojásókba fecskendezzük, és a rendszert 48 órán át 33 C°-on inkubáljuk. A 40 tojások allantoisz-folyadékát külön-külön elválasztjuk, az allantoisz-folyadék 0,2 ml-es mintáit embriót tartalmazó SPF-tojásokba fecskendezzük, majd a tojásokat 72 órán át 33 C°-on inkubáljuk. Minden mintához 2 tojást használunk fel. Az in-45 kubálási idő leteltekor a pozitív vírus-reakciót adó allantoisz-folyadékokat elkülönítjük, és a vírus alábbi sajátságait vizsgáljuk: juh-vörösvérsejtek hemagglutinálása, anti-Brigit-szérummal és anti-B/HK/5/72 szérummal szemben kifejtett hatás, 50 növekedés tojásokon és héjas allaxitoiszon (AOS). Az így kapott vírus-szuszpenziók egyikét embriót tartalmazó tyúktojáson való véghígításos tenyésztésnek vetjük alá. Az így -kapott klón amely-55 nek antigén-jellege a B/HK/5/72 törzsével, AOS-rendszerben kifejtett fertőzőképessége pedig a Brigit alaptörzsével egyezik meg, R 75 törzsnek neveztük el, és az Americon Type Culture Collection gyűjteményben ATCCVR789 számon helyez-60 tük letétbe. Az R 75 rekombinánst nagymennyiségű vírusanyag termelése céljából embriót tartalmazó SPF-tyúktoj ásókon kétszer tenyésztjük. A rekombináns törzs, valamint az alaptörzsek 65 jellemző sajátságait a 4. táblázatban közöljük. 7
