170481. lajstromszámú szabadalom • Eljárás uteroevakuáns hatóanyagok elkülönítésére növényi anyagokból
13 170481 14 50 g, a fenti módon kapott nyers maradékot 5 liter éterben oldunk. Az oldatot szűrjük, és a szűrletet 500 ml telített, vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal mossuk. Az éteres fázist vízmentes nátriumszulfát fölött szárítjuk, szűrjük, majd az oldószert lepároljuk. A kapott 44,6 g halványsárga, olajos maradékot 400 ml kloroformban oldjuk, és az oldatot kloroformmal átitatott 2,5 kg semleges kovasawal töltött, 10 x 120 cm méretű oszlopra öntjük. Az oszlopot kezdetben kloroformmal, majd növekvő mennyiségű izopropanolt tartalmazó kloroform-izopropanol elegyekkel eluáljuk. Az eluátumot frakciókba gyűjtjük, összesen 110. frakciót fogunk fel. Az eluáláshoz a következő oldószer-elegyeket használjuk fel: Frakció száma Egy frakció térfogata, ml Oldószer 1-7. 650 kloroform 8-30. 500 1 : 41,7 arányú izopropanol-kloroform elegy 31-60. 500 1 : 33,3 arányú izopropanol-kloroform elegy 61-105. 500 1 :28 arányú izopropanol-klorofrom elegy 106-110. 500 1 :25 arányú izopropanol-kloroform elegy 10 15 20 25 30 35 A frakciók összetételét vékonyrétegkromatográfiás elemzéssel (adszorbens: szilikagél, eluálószer 1 : 12,5 arányú izopropanol-kloroform elegy), valamint gáz- 40 kromatográfiás elemzéssel [3% OVI7 (1:1 arányú metilszilikon-fenilszilikon) oszlop, 150-250 C° ] vizsgáljuk. A 78—84. frakciót egyesítjük, és az oldószert vákuumban lepároljuk. 5,1 g súlyú olajos maradékot kapunk, amely gázkromatográfiás elemzés alapján 4 5 legalább három fő komponenst tartalmaz. 3,2 g, a fenti módon kapott olajos maradékot 50 ml benzolban oldunk, és az oldatot benzollal átitatott 2 kg OR-PVA Merck-O-Gel 2000 adszor- 50 benssel (szerves oldószerekben duzzadó vinilacetát-kopolimer, az E. Merck cég gyártmánya) töltött, 10x90 cm méretű oszlopra öntjük. Az oszlopot benzollal eluáljuk. Összesen 47 frakciót gyűjtünk össze, az 1-7. és 46-47. frakció térfogata 5 5 1000-1000 ml, míg a 8-45. frakció térfogata 300-300 ml. A frakciók összetételét vékonyrétegkromatográfiás és gázkromatográfiás elemzéssel vizsgáljuk. 60 A 23-33. frakció a felvitt anyag 54%-át (= 1,73 g) tartalmazza. A 24-25. frakció bepárlásával 0,251 g olajos terméket különítünk el, amelynek fizikai állandói a következők: 65 Infravörös spektrum (hígítatlan minta): 2,90, 5,96 és 6,21 ß. NMR-spektrum (CDC13 , TMS): 6,11, 5,48, 4,25, 4,13, 3,56,2,11,2,08, 1,48, 1,13 és 1,01 ppm. A 31. frakció bepárlásával 0,326 g olajos terméket különítünk el, amelynek fizikai állandói a következők: Infravörös spektrum (hígítatlan minta): 2,91 és 5,88ju. NMR-spektrum (CDC13 , TMS): 5,41, 4,26, 4,15, 3,58, 3,18, 2,18, 1,76, 1,67, 1,15 és 1,04 ppm. A hatóanyagok méhösszehúzó hatását a következő módszerrel vizsgáljuk: Nemileg érett nőstény New Zealand nyulakat nátrium-pentobarbitállal altatunk, és az állatok petefészkét eltávolítjuk. 1 hetes gyógyulási idő elteltével a nyulaknak szubkután úton 6 napon át napi 5jug 170-ösztradiolt, majd 7 egymást követő napon át szubkután úton napi 1,0 mg progeszteront adunk be. Az utolsó progeszteron-dózis beadását követő 72 óra elteltével a nyulak méhét és petevezetékét perfundáljuk. A perfúziót Heilman és munkatársai módszerének (Fertil. Steril. 23, 221) kissé módosított változata szerint végezzük. A petevezetéket és a méhet 53 jul/perc sebességgel'perfundáljuk. A méh perfundálására szolgáló csövet a petevezeték végétől 1,0 cm távolságig a méhüregbe vezetjük. A méhet a méhkürt-csatlakozásnál lekötjük. A vaginát kissé bemetsszük, és a perfúziós folyadék összegyűjtése céljából a bemetszésen keresztül 1,0 cm távolságig egy további kanült vezetünk a méhbe. A vizsgálandó hatóanyagot polietilénglikol 200-at, polietilénglikol 400-at, etanolt és foszfátpuffert tartalmazó hordozóanyaggal elegyítve intravénásán adjuk be az állatok juguláris vénájába. A kanült egy P23-Dc Stathan típusú transzducerhez kapcsoljuk, a transzducert Grass Model 5 kiíró szerkezethez kötjük, és a méh összehúzódásait regisztráljuk. A 31. frakcióból elkülönített hatóanyag intravénás adagolás esetén 1,0-4,0 mg/kg dózisban okoz méhösszehúzódásokat és petevezeték-ernyedést a progeszteronnal 72 óra óta nem kezelt nyulakon. Ugyanezen kísérleti körülmények között a 24-25. frakcióból elkülönített hatóanyag 25-40 mg/kg-os dózisban hatásos. Az uteroevakuáns hatóanyagok terhességmegszakító hatását a következőképpen vizsgáljuk: Nemileg érett, Hartley-törzsbeli nőstény tengerimalacokat egy-egy hímmel hosszabb időre közös ketrecekbe zárunk, mindaddig, amíg a ketrecben vaginalis pamatot (párosodási pamatot) nem találunk. Ezt a napot tekintjük a terhesség első napjának. A terhesség 22. napján 5-6 nőstény állatból álló csoportok tagjainak intraperitoneális úton a fent ismertetett hordozóanyaggal elegyített hatóanyagot adjuk be. A tengerimalacokat a terhesség 25-45. napján leöljük, az állatokat felboncoljuk, és megvizsgáljuk az embrió felszívódását vagy a vetélés jeleit. A 31. frakcióból elkülönített hatóanyag intraperitoneális adagolás esetén 25-85 mg/kg-os dózisban vált ki terhességmegszakító hatást. 7
