170461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízben oldható enzimek immobilizálására polivinilalkohol-gélbe zárás útján

7 170461 8 6. példa Pszeudo-kolinészteráz bezárása beszárítással készített polivinilalkohol filmbe 5 Lószérumból előállított pszeudo-kolinészterázból (Reanal gyártmány) 8 mg/ml-es oldatot készítünk foszfát-pufferben való feloldással. Az 1. példa szerinti módon elkészített 5 ml polivinilalkohol-oldathoz 0,5 ml pszeudo-kolinészteráz- 10 oldatot adunk, tökéletesen elkeverjük, majd a továbbiakban az 1. példa szerinti módon járunk el. Aktivitásra számolt kitermelés: 10%. 15 7. példa Penicillin-aciláz bezárása beszárítással készített polivinilalkohol filmbe 20 Escherichia coli-ból penicillin-acilázt izolálunk Szentirmai módszere szerint [Appl. Microbiol., 12, 185 (1964)]. Az izolált enzimet liofilizált por alakjában használjuk fel. Az 1. példában leírt módon készített 5 ml poli- 25 vinilalkohol-oldathoz szobahőmérsékleten 20 mg liofilizált enzimet adunk, és a teljes feloldódásig keverjük. Az így kapott enzimet tartalmazó oldatból az 1. példában leírt módon filmet öntünk, azt súlyállandóságig szárítjuk, majd mossuk. Aktivitásra 30 számolt kitermelés: 40%. A többi enzim 1-5% veszteség mellett a mosófolyadékban kimutatható. 8. példa 35 Penicillin-aciláz bezárása beszárítással készített polivinilalkohol filmbe, bifunkciós reagenssel végzett utólagos kezelés alkalmazásával 40 A 7. példában leírt módon készített, súlyállandóságig szárított, de ezután még nem kimosott preparátumot szobahőmérsékleten 30 percre 5%-os glutárdialdehid-oldatba helyezzük, majd foszfát- 45 -pufferes mosást végzünk. Aktivitásra számolt kitermelés: 60%. 9. példa 50 Aldoláz bezárása kémiai térhálósítással készített polivinilalkohol hidrogélbe beszárítással Az 1. példában leírt módon polivinilalkohol-olda- 55 tot készítünk, amelyből kémiai térhálósítással gélt készítünk olyan módon, hogy az 5%-os polivinilalkohol-oldathoz 100 ml desztillált vizet, majd 1 ml 25%-os szukcindialdehid-oldatot és 10 ml 2 N sósavoldatot adunk. A gélképződés szobahőmérsék- 60 léten néhány óra alatt lejátszódik. A keletkezett gélt turmix-berendezésben felaprítjuk, majd desztillált vízzel végzett dekantálással a savat kimossuk belőle. A gél szobahőmérsékleten vízben néhány hónapig változás nélkül eltartható. 65 Az enzim gélbe való bezárásához először megállapítjuk a gél üledék-térfogatát, majd a vizet vákuumban való szűréssel eltávolítjuk róla. A leszívatott gélhez üledék-térfogatának 75%-át kitevő mennyiségű, 5 mg/ml koncentrációjú, az 1. példában leírt módon készített aldoláz-oldatot adunk, majd olvadó jéggel végzett hűtés mellett fél óra hosszat enyhén keverjük. Az elegyet 10 órán át 5 C°-on állni hagyjuk, majd a gélt újból leszívatjuk, és a folyadékfázisban maradt enzim mennyiségét meghatározzuk. Ebből számítjuk a bediffundált enzim mennyiségét. A leszívatott gélt liofilizáljuk, vagy 5—10 C°-on vákuum-szárítószekrényben súlyállandóságig szárítjuk. A szárítás után a kioldható enzimet az 1. példában leírt módon eltávolítjuk. Immobilizált, aktív formában a bediffundált mennyiség 9-10%-át kapjuk meg. A kimosott preparátum újra liofilizálható, és ilyen állapotban 5 C°-on tárolva több hónapon át gyakorlatilag nem veszít aktivitásából. 10. példa Aldoláz bezárása kémiai térhálósítással készített polivinilalkohol-hidrogélbe tömény elektrolitos kezeléssel Az enzimoldat és a gél készítését, valamint az enzimnek a gélbe való bediffundáltatását a 9. példában leírt módon végezzük. A leszívatott gélt ezután behelyezzük olvadó jéggel hűtött, erőteljesen kevert, 7,5 pH-jú telített ammóniumszulfát-oldatba, és abban egy óra hosszat keverjük. A keverés befejezése után a rendszert még 2—3 órán át 5 C°-on állni hagyjuk, majd a kioldható enzimet foszfát-pufferrel való mosással eltávolítjuk. Aktivitásra számolt kitermelés: 10% A preparátum liofilizált állapotban 5 C°-on néhány hónapon át tárolva sem veszít aktivitásából. 11. példa Penicillin-aciláz bezárása fizikai térhálósítással készített polivinilalkohol hidrogélbe liofilizálással Kereskedelmi, kis acetát-tartalmú polivinilalkoholból vízfürdőn való melegítéssel dioxán és víz 1 : 1 arányú elegyében 12 súly% szárazanyagtartalmú oldatot készítünk, majd ezt az oldatot lassan lehűtve gélesítjük. A gélt turmix berendezésben felaprítjuk, majd desztillált vízzel addig mossuk, amíg a jelenlevő dioxán teljes mértékben eltávozik. A 7. példában leírt penicillin-acilázból pH 8,0 foszfát pufferben 30 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Megállapítjuk a gél üledék-térfogatát, majd a vizet vákuumban való szűréssel eltávolítjuk róla. A leszívatott gélhez üledék-térfogatának 75%-át kitevő mennyiségű, a fentiek szerinti penicillin-aciláz oldatot adunk, majd a rendszert 3 óra hosszat, olvadó jéggel hűtve, kevertetjük. Az enzimoldattal átitatott gélt 24 óra hosszat hagyjuk állni, időn-A