170461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízben oldható enzimek immobilizálására polivinilalkohol-gélbe zárás útján

3 I704bl 4 kapszula belsejében az enzim lényegileg vízben oldott állapotban ki tudja fejteni katalitikus aktivitását. A bezárással vízben oldhatatlanná tett enzimkészítmények gyakorlati előnye a más módszerekkel immobilizált enzimekkel szemben, hogy vé- 5 dettek a reakcióelegyben levő nagy molekulasúlyú károsító anyagokkal és proteolitikus enzimekkel szemben. Állatkísérletekben kimutatták, hogy a mikrokapszulába zárt enzimek nem okoznak immunológiai problémákat, védettek a befogadó szer- 10 vezet proteolitikus enzimjeinek támadásával szemben, és trombogenetikus hatásuk is kiküszöbölhető (3 522 346 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). Az enzimek gélbe zárással való immobilizálására 15 legelterjedtebben a sok keresztkötést tartalmazó poliakrilamid-gélt alkalmazzák. Az egyik ismert eljárás szerint az enzim oldatához akrilamid és N,N'metilén-bisz-akrilamid monomereket adnak, és a polimerizációs reakciót iniciátor hozzáadásával 20 indítják meg [Bernfeld és Wan: Science, 142, 678 (1963), Mosbach: Acta Chem. Scand., 24, 2084 (1970)]. Iniciátor helyett 7-sugárzást is lehet alkalmazni [Dobó: Izotóptechnika, 4, 215 (1973)]. A kapott termék: enzimet tartalmazó gél. 25 A gélbe zárással való immobilizálásra a poliakrilamidon kívül más.gélek is felhasználhatók. így például leírták 20% polivinil-pirrolidont tartalmazó 2-hidroxi-etil-metakrilát-gél (O'DriscoU et al.: Bio- 30 technol. Bioeng., 14, 847 (1972), Hinberg et al.: Biotechnol. Bioeng., 16, 159 (1974), di- vagy polialkoholok di- vagy poli(met)akrilátjainak a-jS telítetlen dikarbonsavak anhidridjeivel alkotott kopolimerizátuma (1 215 539 számú német közre- 35 bocsátási irat), valamint elektródákon való kicsapással készített kollagén [Wang és Vieth: Biotechnol. Bioeng., 15, 93 (1973)] felhasználását enzimek bezárására. Egy másik ismert eljárás szerint [Maeda 40 et al.: Biotechnol. Bioeng, 15, 607 (1973)] polivinilalkohol-gélt használnak fel enzimek immobilizálására olyan módon, hogy az enzimet és a polivinilalkohoít tartalmazó oldatot 7-sugárzásnak vetik alá, ebben az eljárásban a bezárt glükoamiláz és 45 invertáz enzimek aktivitásának 75-90%-a vész el a bezárás folyamán. Kísérleteink során megállapítottuk, hogy a különböző ismert gélbezárási módszerek során alkalmazott reakciókörülmények, illetve vegyszerek, 50 részben pedig a keletkező szabad gyökök gátolják a legtöbb enzim működését. A radioaktivitás károsító hatásának mértéke jól látható a fentebbi legutolsó irodalmi adatból. A találmány célja általánosan használható, egy- 55 szerű és gazdaságos eljárás biztosítása vízben oldható enzimek gélbe zárással való immobilizálására olyan módon, hogy az eljárás során az enzimet ne érje károsító kémiai hatás vagy radioaktív sugárzás. A találmány további célja a bezárt enzim hőstabili- 60 tásának megnövelése a vízben oldott enzim hőstabilitásához képest, továbbá gélképzés, illetve bezárás körülményeinek változtatása révén mind film, mind granulátum termék előállításának lehetővé tétele. 65 A- találmány alapja az a felismerés, hogy vízoldható enzimek polivinilalkohol-gélbe zárása az enzim aktivitásának csökkenése vagy elvesztése nélkül is megoldható, ha az enzim és a gél vizes oldatát beszárítjuk, vagy az enzimet polivinilalkohol-gélbe diffundáltatjuk, majd a gél pórusait fizikai úton csökkentjük. Ez a felismerés azért meglepő, mert a technika ismert állása alapján az volt várható, hogy a gél pórusméretének nagymértékű megváltoztatása esetén a jelenlevő egyéb makromolekulák, vagyis az enzimek maradandó változást szenvednek. A felismerés továbbá azért is meglepő, mert ismeretes, hogy az enzimek levegőn szárítva gyorsan denaturálódnak. Ezért az volt várható, hogy szárítás közben az enzim aktivitása nagymértékben lecsökken. Fentiek alapján a találmány eljárás vízben oldható enzimek immobilizálására, az enzimnek polivinilalkohol-gélbe zárasa útján. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a) 0,005-3 súly% enzimet, 3-15 súly% polivinilalkoholt, és adott esetben 0,05-8 súly% társpolimert és/vagy adalékanyagot, előnyösen polivinilpirrolidont vagy poliakrilamidot és/vagy inert fehérjét, célszerűen szérumalbumint vagy zselatint tartalmazó oldatból beszárítással filmet készítünk, vagy b) 3-15súly%-os polivinilalkohol oldatból fizikai vagy kémiai térhálósítással készített gélbe 0,005-5 súly% töménységű enzimoldatból, amely adott esetben 0,05—8 súly% társpolimert és/vagy adalékanyagot, előnyösen polivinilpirrolidont vagy poliakrilamidot, és/vagy inert fehérjét, célszerűen szérumalbumint vagy zselatint tartalmaz, a komponenseket a gélbe bediffundáltatjuk, majd a gél porozitását fizikai úton, előnyösen beszárítással, liofilizálással vagy elektrolitos kezeléssel csökkentjük, és adott esetben az így kapott immobilizált enzim-készítményt dialdehiddel, előnyösen glutárdialdehiddel kezeljük. A találmány szerinti eljárás b) változatában a gél porozitásának csökkentésére célszerűen elektrolittal végzett kezelést, szárítást vagy liofilizálást alkalmazhatunk. Az elektrolittal végzett kezelésre ammóniumszulfátot vagy alkálifém-szulfátot, elsősorban nátriumszulfátot célszerű használni. A találmány szerinti eljárás a) változata értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy a polivinilalkoholt, az enzimet és az esetleges adalékanyagokat tartalmazó oldatból kiöntéssel és szárítással filmet készítünk. Ha ezt a filmet vizes oldatba helyezzük, már nem oldódik fel, hanem csak megduzzad, és így az enzim-molekulák egy része immobilizált állapotban a gél belsejében marad. A keletkező film mechanikai tulajdonságai szükség esetén megjavíthatok olyan módon, hogy a filmképző elegyet hordozóra, például textíliára vagy szűrőpapírra visszük fel, és ezen szárítjuk be. A találmány szerinti eljárás b) változata értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy polivinilalkohol térhálósításával polivinilalkohol-gélt készítünk, majd a kapott gélhez hozzáadjuk a bezárni kívánt enzim vizes oldatát, és néhány órán át tartó inkubálás után a gél pórusméretét fizikai úton lecsökkentjük. 2