170437. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dez-Lys29-Ala30-inzulin- származékok előállítására
9 10 karbonátot és 1,0 mól nátriumkloridot tartalmaz). A mosott szuszpenzióhoz ezután 13,5 ml, a fenti pH = 8,0 értékű pufferoldattal készített, 5 mg AM-proteázt tartalmazó oldatot adunk, és az elegyet 12 órán át 4 C°-on keverjük. A szilárd anyagot 1 liter fenti, 8,0 pH-értékű pufferoldattal mossuk, majd 2 órán át 1 mólos etanolamin-oldatban (pH = 8,0) tartjuk. A szilárd anyagot egymás után 1,0 mól nátriumkloridot tartalmazó, 4,0 pH-értékű, 0,1 mólos nátriumacetát-ecetsav pufferoldattal, majd 1,0 mól nátriumkloridot tartalmazó, 8,5 pH-értékű 0,1 mólos nátriumborát pufferoldattal mossuk. Ezt a mosási műveletet négyszer megismételjük. A kovalensen kötött enzimet tartalmazó agaróz-szemcséket ezután 8,2 pH-értékű 0,1 mólos ammónium-hidrogénkarbonát pufferoldattal egyensúlyba hozzuk. 7. példa Milliliterenként 1 mg sertés-inzulint (tízszer átkristályosított anyag) tartalmazó oldatmintákat AM-proteáz enzim (enzim: szubsztrátum arány = 1 : 1000) és 10"1 , 10 -2 , 10 -3 , illetve 10 mól koncentrációjú magnéziumklorid jelenlétében 8,0pH-értéken 2 órán át 40C°-on inkubálunk. A 2. példában ismertetett elemzés szerint a 10"1 mól koncentrációjú magnéziumkloridot tartalmazó mintában 90%-os, a 10-2 és 10~ 3 mól koncentrációjú magnéziumkloridot tartalmazó mintákban 75%-os, és a 10"4 mól koncentrációjú magnéziumkloridot tartalmazó mintákban 65%-os hasítás lép fel. Magnézium távollétében végzett inkubálás esetén a hasítás mértéke 68%. 8. példa 150 mg kristályos marha-inzulin 2 ml vízzel készített, pH = 8,3 értékre pufferolt, 10~2 mól kalciumkloridot tartalmazó oldatát 140 jug AM-proteáz jelenlétében 3 órán át 37 C°-on inkubáljuk. Az inkubálás alatt az elegybe automatikus pH-szabályozó segítségével 0,02 mólos nátriumhidroxid-oldatot adagolunk, és így az elegy pH-ját 8,3 értéken tartjuk. Az oldat 10/il-es mintáját az 1. példában ismertetett aminosavelemző készüléken elemezzük, azzal a különbséggel, hogy az eluálást 1 percig 3,28 pH-értéken, 1 percig 4,25 pH-értéken és 60 percig 6,65 pH-értéken végezzük, és ezután regeneráljuk az oszlopot. Inzulin-csúcs (eluálási idő: 90 perc) nem észlelhető, azonban mind a dez-Lys29-Ala 30 -marha-inzulin csúcs (eluálási idő: 80 perc), mind a Lys-Ala csúcs (eluálási idő: 120 perc) megjelenik. Az inkubált oldatot liofilizáljuk, és a szilárd anyagot 2 ml 1 mólos ecetsavban oldjuk. A kapott oldatot az 5. példában leírt módon 4C°-on gélszűrésnek vetjük alá, azzal a különbséggel, hogy oldószerként 1 mólos ecetsav-oldatot használunk. A 280 nm hullámhosszon meghatározott ultraibolya abszorpció alapján a főcsúcsnak megfelelő frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. 113 mg dez-Lys2 9 -Ala 3 ° -marha-inzulint kapunk. Poliakrilamid-gélen 8,9 pH-értéken végzett elektroforézis során (előhívószer: amido-fekete) a termék egyetlen foltot ad. A termék marha-inzulinhoz viszonyított anódirányú mozgékonysága 1,2. A termék teljes aminosav-elemzése azt mutatja, hogy a 5 termék lizint nem tartalmaz és csak két alanin-csoportot hordoz, egyebekben az aminosav-összetétel azonos a marha-inzulinéval. Az 1. példában ismertetett módszerrel N-terminális aminosavként csak glicint és fenilalanint mutattunk ki. 9. példa 150 mg egyszer átkristályosított sertés-inzulint 15 In ammóniumhidroxid-oldat adagolása közben vízben oldunk, és az oldat térfogatát 0,1 mólos ammónium-hidrogénkarbonát oldattal 3,0 ml-re egészítjük ki. Az elegyhez 0,5 ml AM-proteáz-oldatot (150jug AM-proteáz) adunk, és az oldatot 11 órán 20 át 37C°-on tartjuk. Az elegy mintáját a 8. példában megadott módon elemezzük. Az elemzés szerint a hasítás teljes mértékben végbement. Az oldatot 3 ml 40 térfogat%-os vizes ecetsav-oldattal hígítjuk, és a kapott oldatot Sephadex G-50-nel 25 töltött, 160x2,0 cm méretű oszlopra visszük fel. Az oszlopot 20 térfogat%-os vizes ecetsav-oldattal eluáljuk. Az eluátum peptid-tartalmát a 280 nm hullámhosszon mutatott ultraibolya abszorpció mérésével vizsgáljuk. Az eluálást 15 ml/óra sebességgel 30 végezzük, és 300 cseppes frakciókat fogunk fel.'Az inzulin-csúcs a 45—56. frakciókban jelenik meg. Ezeket a frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. 135 mg dez-Lys29 -Ala 30 -sertés-inzulint kapunk. A fenti körülmények között a I 125 izotóppal jelzett 35 AM-proteáz a 36—43. frakciókban jelenik meg. Szabadalmi igénypontok: 40 1. Eljárás az (I) általános képletű dez-Lys2 9 -Ala3 °-inzulin-származékok —ahol R 1 treonin-csoportot és R2 izoleucin-csoportot jelent, vagy R 1 alanin-csoportot és R2 valin-csoportot jelent —, továbbá főtömegében (I) általános képletű dez-45 -Lys 29-Ala 30 -inzulin-származékokat tartalmazó keverékek előállítására, azzal jellemezve, hogy sertésvagy marha-inzulint, illetve főtömegében sertésvagy marha-inzulint tartalmazó keveréket vizes közegben, adott esetben alkáliföldfém-ionok jelenlé-50 tében, AM-proteáz-enzim hatásának teszünk ki, majd a kapott terméket önmagában ismert módon elválasztjuk az enzim maradékától, a lizil-alanintól és az adott esetben jelenlevő oligopeptidektől. (Elsőbbsége: 1972. december 28.) 55 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az enzimes kezelést oldatban, 3 és 10 közötti pH-értéken, 10-60 C°-on végezzük. (Elsőbbsége: 1972. december 28.) 3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási 60 módja, azzal jellemezve, hogy az enzimes kezelést 7 és 9 közötti pH-értéken, 30-50 C°-on, 1 : 1000 és 1:10 000 közötti enzim: szubsztrátum arány fenntartásával végezzük, és az inzulint 200—400 mg/ml koncentrációban alkalmazzuk. (El-65 sőbbsége: 1972. december 28.) 5
