170437. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dez-Lys29-Ala30-inzulin- származékok előállítására
170437 Amint már korábban közöltük, a reakciót hordozóhoz kötött — célszerűen kovalens kötéssel kapcsolódó - enzimmel is végrehajthatjuk. Igen sokféle hordozót és kötésmódot alkalmazhatunk, ezekről az E. Katchalski: „Biochemical Aspects of Reac- 5 tions on Solid Supports" c. szakkönyv (kiadó: G.R. Stark, Academic Press, 1971) ad tájékoztatást. Az AM-proteázt egy szokásos módszer szerint úgy kapcsoljuk a hordozóhoz, hogy agaróz-gél szemcséket adott esetben például hexilaminból 10 vagy hexánsavból származó térkitöltő csoportok jelenlétében brómciánnal aktiválunk, majd az aktivált agarózt az AM-proteázzal reagáltatjuk. Az agaróz-gél szemcséket 2,4-diklór-6-karboximetilamino-s-triazin kapcsolószerrel is aktiválhatjuk. Aktiváló- 15 szerként karboximetil-cellulóz-hidrazidot is alkalmazhatunk. Ha az enzimes kezeléshez pusztán a vizes közegben oldott enzimet használjuk fel, a kapott dez-Lys29-Ala 3 "-sertés- (vagy marha)-inzulint a poli- 20 peptidek elkülönítésére alkalmas bármely szokásos módszerrel elválaszthatjuk a reakcióközeg egyéb komponenseitől. Előnyösen a molekulaszűrős elválasztási módszert alkalmazzuk. Ennek megfelelően a kiindulási inzulin teljes mértékű lebomlása után 25 kapott vizes közeget 5 000-10 000 molekulasúlyú vegyületeket tetszés szerinti pH-értéken, előnyösen a polipeptidek izoelektromos pontjától távol eső, célszerűen a polipeptidek izoelektromos pontjánál lényegesen alacsonyabb pH-értéken frakcionálni ké- 30 pes keresztkötéses dextrángél- vagy polialkrilamid-gél-oszlopon szűrjük, majd az oszlopot nagy vákuumban végzett liofilizálás esetén illékony komponensekből, például vizes ecetsavból, ammóniumkarbonátból vagy ammóniumacetátból készített 35 pufferoldattal eluáljuk, végül az eluátumból liofilizálással elkülönítjük a kívánt terméket. Ha az enzimes kezeléshez hordozóhoz kötött enzimet használunk fel, a polipeptidet szűréssel különíthetjük el az enzimtől. Ha vizes közegben 40 oldhatatlan hordozót alkalmaztunk, a szűrést hagyományos módszerekkel végezhetjük, míg vizes közegben oldódó hordozó alkalmazása esetén szűrőanyagként nagymolekulasúlyú polimereket használhatunk. 45 Amint már korábban közöltük, a találmány szerint előállított termékek inzulin-szerű hatással rendelkeznek, és hosszabb időn át adagolva a kiindulási anyagnál lényegesen kisebb mértékben vezetnek a hatóanyagokat megkötő antitestek kialakulásához. 50 A vegyületek inzulin-szerű hatásának kimutatása során a vegyületek adagolásakor fellépő vércukorszint-csökkenést vizsgáltuk nyulakon, a United States Pharmacopeia 18. kötetének 883. oldalán közölt módszer szerint. E mérésben azonos mennyi- 55 ségű WHO-standard inzulin, illetve a találmány szerint előállított termék — a mérési hibahatárokon belül - azonos vércukorszint-csökkenéshez vezetett. Az antitestek kialakulásának csökkenését a következő módszerrel mutattuk ki: a vizsgálandó vegyü- 60 letet teljes Freund-féle adjuváns és fiziológiás sóoldat 50 :50 arányú elegyében oldva nyulaknak adtuk be, majd 1 hónap elteltével meghatároztuk a nyulak vérszérumának inzulin-megkötő képességét. Az utóbbi mérés során a vérszérumhoz ismert 65 mennyiségű, I 12 5 izotóppal jelzett inzulint adtunk, és megmértük a kötött, illetve a szabad jelzett inzulin mennyiségét. Ez a mérés ismert módszereken alapul (lásd például Schlichtkrull és munkatársai: „Diabetes" 21. kötet, 2. pótkötet, 1972, 649-656. oldal). A találmány szerint előállított új polipeptideket lényegében a sertés- vagy marha-inzulinnal azonos módon használhatjuk fel a diabetes kezelésére. E vegyületeket parenterálisan — rendszerint szubkután úton - adjuk be oldat, vagy nyújtott hatású készítmény formájában. A nyújtott hatású készítmények 24 órán át tartó hatást is biztosíthatnak. A dózist a beteg állapotától függően egyénenként állapítjuk meg. A vegyületeket nagy - például napi 200 egységnek megfelelő - dózisban is adagolhatjuk. A találmány szerint továbbá hatóanyagként dez-Lys2 9 -Ala 3 ° -sertés-inzulint vagy dez-Lys2 9 -Ala 3 ° --marha-inzulint tartalmazó injektálható készítményeket állítunk elő. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A példákban említett „Sephadex" és „Sepharose" megjelölések védjegyek. 1. példa 10 mg tízszer átkristályositott sertés-inzulint 1,0ml 0,1 mólos ammónium-hidrogénkarbonát oldatban oldunk, az elegyhez 50 Mg AM-proteázt adunk, és az elegyet 16 órán át 37 C°-on inkubáljuk. A kapott elegy 10 ^d térfogatú mintájában az ismert denzilezési módszerrel, 1-dimetilamino-naftalin-5-szulfonilklorid felhasználásával [lásd Hartley: Biochem. J. 119, 805 (1970)] meghatározzuk az N-terminális aminosavakat. E módszerrel az inzulin „A" peptidláncából származó glicint, az inzulin „B" peptidláncából származó fenilalanint, és a lizil-alaninból származó lizint mutattuk ki. Az elegy egy további mintáját ecetsav-hangyasav rendszerben (20 ml hangyasav és 80 ml ecetsav, vízzel 1 literre kiegészítve), pH = 2,1 értéken papír-elektroforézisnek vetjük alá. E vizsgálat során H-Lys-Ala-OH-t, és egy második komponenst mutattunk ki (a komponensek e-DNP-lizinre vonatkoztatott mozgékonysága 2,9, illetve 1,5). A második komponenst eluáljuk, és meghatározzuk az N-terminális aminosavakat. Glicint és fenilalanint mutattunk ki. A teljes aminosav-elemzés szerint ez a komponens az egyes aminosavakat a következő arányokban tartalmazza: aszparaginsav 3, szerin 3, treonin 2, glutaminsav 7, prolin 1, glicin 4, alanin 1, valin 4, izoleucin 2, leucin 6, fenilalanin 3, tirozin 4, hisztidin 2, arginin 1 és cisztein (az utóbbi aminosav mennyiségét nem határoztuk meg pontosan). Ennek megfelelően a kapott termék abban tér el a sertés-inzulintól, hogy lizint nem tartalmaz, és csak egy alanin-csoportot tartalmaz. Az elegy harmadik mintáját Locarte Amino-acid Analyser (a Locarte Ltd., 24 Emperor's Gate, London S.W. 7 cég gyártmánya) aminosavelemző készülék műgyantaoszlopának tetejére visszük fel, és a 23 cm hosszú műgyantaoszlopot szokásos módon 55 C°-on eluáljuk. Az eluálást 90 percig 3
