170418. lajstromszámú szabadalom • eljárás Rhizopus oryzae törzs lipáz-termelésének növelésére
5 170418 6 Az 1. táblázat adataiból látható, hogy az 1 metilén-csoporttal hosszabb polipropilénglikol már gátló hatást fejt ki, polietilénglikol jelenlétében viszont lényegesen nagyobb lipáz termelési szintet értünk el, mint napraforgóolaj adagoláskor. 5 A fentiek alapján a találmány eljárás Rhizopus oryzae törzs (MNG135) lipáz-termelésének növelésére süllyesztett, aerob kultúrában, szerves szenes nitrogénforrást tartalmazó táptalajon, amely abban áll, hogy a tenyésztés előfermentációs 10 szakaszát 1—4% triglicerid, előnyösen napraforgóolaj jelenlétében végezzük, és az így kapott tenyészetet 0,01 — 0,3% polietilénglikol jelenlétében fermentáljuk. A találmány szerinti eljárás egy előnyös 15 kivitelezési módja szerint úgy járunk el, hogy az általunk izolált Rhizopus oryzae törzset (letétbe helyezve az OKI-nál MNG 00135 számon) 20-28 C°-on komplex fehérjét, szerves szénforrást és adalékokat tartalmazó táptalajon, aerob körül- 20 menyek között tenyésztjük. Komplex fehérjeként peptont, kazeint, kukoricalekvárt, szójalisztet vagy mogyorólisztet, szénforrásként glükózt, szacharózt, laktózt, vagy burgonyakeményítőt használunk. A szervetlen sók közül a magnéziumszulfát és 25 kalciumkarbonát is elősegíti a növekedést és az enzimtermelést. A törzs fenntartását napraforgóolaj tartalmú táptalajon végezzük. Az inokulum és a termelő táptalaj pH-ját sterilezés előtt 6,0-ra állítjuk. A 30 táptalaj sterilezését 121 C°-on előnyös végezni, a táptalaj térfogatától függően 30-60 percig. A steril inokulum táptalajt — melynek összetétele: 2% glükóz, 2% szójaliszt, 1% kukoricalekvár (50%-os), 0,05% MgS04 • 7H 2 0, 1% CaC0 3 , 1% 35 kazein (pankreatinnal emésztve), 1% napraforgóolaj, csapvízzel 100%-ra feltöltjük - a Rhizopus oryzae (MNG 00135) spóraszuszpenziójával oltjuk, majd 40-48 órán át 24 C°-on tenyésztjük. A kinőtt inokulum tenyészetről 1—10%-kal oltjuk a steril 40 fermentációs táptalajt — melynek összetétele: 3% glükóz, 2% szójaliszt, 2% amerikai mogyoróliszt, 3% kukoricalekvár (50%-os), 2% kazein (pankreatinnal emésztve), 2% CaC03 , 0,05% MgS0 4 • 7H 2 O, csapvízzel 100%-ra feltöltjük -és 24 C°-on te- 45 nyésztjük 80—100 órán át, levegőztetés, keverés mellett. A fermentáció során 0,01 -0,3% polietilénglikolt adagolunk. A fermentáció befejezése után a micéliumot szűréssel vagy centrifugálással eltávolítjuk. A pH 6,0-ra beállított szurletből az 50 enzimet a 160 109 számú magyar szabadalmi leírás szerint nyerjük ki 45-55%-os kitermeléssel. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: 55 A találmány szerinti fermentációs eljárással magas aktivitású (500-600 E/ml) lipázt tartalmazó oldat állítható elő. Az eljárást követő kinyerési módszerrel kapott lipáz készítmény igen előnyös tulajdonságú és így 60 közvetlenül humán gyógyászati célra is alkalmas. Az eljárással kapott enzim tulajdonságai a következők: Por alakban, szobahőmérsékleten tárolva több éven keresztül nem veszít lipáz aktivitásából. 65 Oldatban 0-37 C° között 4 órán át nem csökken a lipáz aktivitása, 50 C°-on 1 óra alatt az enzim-aktivitás 90%-a elvész. A kalciumklorid 1 mM koncentrációban, a Na-taurokolát 0,05%-ban aktivál. Az enzifn jól működik 20-37 C° között, az optimum 30-37 C° között van. Az enzim pH optimuma 8,5, de jól működik pH 7,0 - 9,5 között. Az enzim Sephadex G—100 oszlopkromatográfiás adataiból számolt molekulasúlyát 50 000-nek találtuk. A találmány szerinti eljárás foganatosítására a következő kiviteli példát adjuk meg: 1. példa Rhizopus oryzae (MNG 00135) spóraszuszpenziójával beoltunk 100 ml steril inokulum táptalajt, melynek összetétele a következő: 2% glükóz, 2% szójaliszt, 1% kukoricalekvár (50%-os), 0,05% MgSO-4 • 7H2 0, 1% CaC0 3 , 1% kazein (pankreatinnal emésztve), 1% napraforgóolaj, csapvízzel 100%-ra kiegészítve. 'A pH-t 6,0-ra állítjuk, és a táptalajt 30 percig sterilezzük 121 C°-on. A tenyésztést 40-48 órán át végezzük 24 C°-os síkrázó-gépen, fordulatszám: 300, amplitúdó: 2,5 cm. A besűrűsödött tenyészetről oltjuk a steril termelő táptalajt, melynek összetétele a következő: 3% glükóz, 2% szójaliszt, 2% amerikai mogyoróliszt, 3% kukoricalekvár (50%-os), 2% kazein (pankreatinnal emésztve), 2% CaC03 , 0,05% MgS04 • 7H 2 0, csapvízzel 100%-ra kiegészítve. A pH-t 6,0-ra állítjuk, és a táptalajt 30 percig sterilezzük 121 C°-on. A tenyésztést az inokulumhoz hasonlóan végezzük. Oltás után közvetlenül és 24 és 48 órás korban 0,1-0,1% polietilénglikolt adagolunk. A 90 órás tenyészetben a lipáz aktivitás: 580 E/ml. 2. példa Rhizopus oryzae (MNG 00135) spóraszuszpenziójával beoltunk 5 liter 1. példa szerinti inokulum táptalajt, melyet 10 literes laboratóriumi fermentor készülékben sterilizáltunk. A tenyésztést 24 C°-on végezzük 400 fordulat/perc keverés és 5 liter/perc levegőztetés ' mellett. Habzásgátlóként napraforgóolajat adagolunk szükség esetén. A 40—48 órás sűrű inokulum-tenyészettel beoltjuk az 5 liter termelő táptalajt, melynek összetétele megegyezik az 1. példa szerinti táptalajjal, kiegészítve 0,2% napraforgóolajjal. (A napraforgóolaj a sterilezés alatti habzás megakadályozásához szükséges.) Fermentáció közbeni habzás esetén polietilénglikolt adagolunk, melyből 0,01% fogy a fermentáció folyamán. 84 órán át 24 C°on végezzük a tenyésztést 400 fordulat/perc keverés és 5 liter/perc levegő átáramlás mellett, majd a tenyészetből a micéliumot szűréssel vagy centrifugálással távolítjuk el. A szűrlet lipáz aktivitása: 560 E/ml. A szurletből a lipáz enzimet a 160 109 számú magyar szabadalmi leírás szerint nyerjük ki. 3
