170340. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek előállítására N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximid alkalmazásával

15 170340 16 színű porként 2,4 g (96%-os kitermelés) Z-(Pyr)Glu-His—Pro— NH2

különíthető el. A terméket vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk. A 3. oldószereleggyel vizsgálva 0,43, míg kloroform és metanol 6:1 arányú elegye vei vizsgálva 0,10 Rf-értékkel jellemezhető, Pauli-reagenssel pozitív reakciót adó egyetlen foltot figyelhetünk meg. A fentiekben ismertetett eljárással előállított vegyület 2 g-ját 40 ml metanolban oldjuk, az oldatot 500 mg palládium jelenlétében 4 órán át katalitikusan hidrogénezzük. A katalizátort szűréssel elkülönítjük, a metanolt csökkentett nyomáson, desztillációval eltávolítjuk. A desztillációs maradékot 30 ml etilacetáttal mossuk, szűréssel elkülönítjük és szárítjuk. így 1,45 g (kvantitatív) szintetikus TRH-t kapunk, amelynek tulajdonságai az autentikus minta tulajdonságaival messzemenően egyeznek. [a]p = -42,0° (c = 1,0, metanolban); [a]" = -43,2° (c = 0,6, ecetsavban). A termék aminosav-analízisének eredményei: Glu = 0,98; His = 1,0; Pro = 1,00. A termék n-butanol, ecetsav, piridin, víz 30:6:20:24 arányú elegyével vizsgált papírkromatográfiás Rf-értéke 0,40. 15. példa A )3-(l-24)-kotikotropin előállítása 20 ml DMF-ban 1,6 g (1 mmólM) Z-Ser-Tyr-Ser- M et- Glu-(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH—p-toluolszulfonátot oldunk, az oldatot jégfürdőben lehűtjük és 270 mg HONBI-et és 240 mg DCC-et adunk hozzá. 1 órán át jégfürdőben, majd további 4 órán át szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet. Ezt követően további 240 mg DCC-et adunk hozzá és egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. Reggel 40 ml etilacetát és 80 ml éter lehűtött elegyét adjuk a reakcióelegyhez, a keletkező kristályokat szűréssel elkülönítjük és 50 ml etil-acetáttal mossuk. Jéggel hűtött, 30 ml térfogatú trifluorecetsavban 2,28 g (1 mmólM) BOC-Lys-(Z)-Pro-Val-Gly-Ly s- ( Z)- L y s- (Z)-Arg-(N02

)Árg-(N0

2

)-Pro-Val-Lys-(Z)-Val-Tyr-Pro-OH-t [a Chem. Pharm. Bull., 18, 1288 (1970)] kiadásában megjelent közlemény szerint előállítva] oldunk, az oldatot 10 C° hőmérsékleten 25 percen át keverjük, amialatt a BOC-csoport lehasad. Ezt követően étert adunk a reakcióelegyhez, a kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük és szárítjuk. A por alakú terméket 25 ml DMF-ban oldjuk, az oldathoz 0,28 ml N-etilmorfolint adunk, majd jégfürdőben lehűtjük. A lehűtött oldathoz hozzáadjuk az előzőekben elkészített csapadékot és 30 percen át jégfürdőben, majd további 8 órán át szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet. Ezt követően 120 ml oxidmentes étert adunk az elegyhez, a kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük. Megszárítjuk a terméket, 10%-os vizes metanolból újra kicsapjuk, így 3,7 g nyers, védett csoportokat tartalmazó tetrakozapeptidet kapunk. Ezt a védőcsoportok eltávolítására vízmentes hidrogénfluoriddal a szokásos módon kezeljük, a hidrogénfluoridot desztillációval eltávolítjuk, a desztillációs maradékot Amberlite IRA—400 (acetát) gyantával kezeljük, amikor nyerstermékként j3-(l-24)-kortikotropint kapunk, amelynek aktivitása az adrenális aszkorbinsav-szint depressziója alapján 95— 120 nemzetközi egység (I.U.); [a$ = -84,0 ± 2° (c= 0,5,1%-os ecetsavban). 5 A papírelektroforézis és a papírkromatográfiás vizsgálatok (pH. 1,9; ecetsav- 80%-os hangyasav-víz 15:5:80, 450V; 60 perc -8,5 cm ületve Rf=0,23) szerint a fenti eljárással előállított termék egynemű, Ehrlich-, ninhidrin-, Pauli- és a Sakaguchi-reakciója 10 pozitív. Aminosav-analízisének eredménye (a hidrolízist 5,7 n HCl-val, 105 C° hőmérsékleten, 24 órán át végezzük) a következő: His: 1,0, Lys: 4,08, Arg: 3,10, Glu: 1,02, Ser: 1,89, Gly: 2,0, Pro: 2,95, Val: 3,0, Met: 0,80, Tyr: 1,97 és Phe: 1,00. 15 16. példa LH—RH—rokon vegyületek előállítása 1. A Z-(Pyr)Glu-His-Trp-OBzl előállítása 60 ml dimetilformamidban 4,27 g (10 mmólM) 20 Z-(Pyr)-Glu-His-OH-t, 4,66 g (10 mmólM) HTrp-OBzl-p-toluolszulfonátot és 1,38 ml N-etilmorfolint oldunk. Az oldatot 0 C° hőmérsékletre hűtjük és 3 g HONBI-et és 3,1 g diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá. Két órán át 0 C° hőmérsékle-25 ten, majd további 6 órán át szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet. A melléktermékként keletkező diciklohexilkarbamidot szűréssel elkülönítjük, a szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk. A desztillációs maradékhoz étert adunk, a kivált por alakú 30 terméket szűréssel elkülönítjük és etilacetáttal mossuk. Ezután 20 ml 5% metanolt tartalmazó kloroformban oldjuk az előállított terméket, az oldatot 500 ml, előzőleg hasonló oldószereleggyel mosott szilikagélből készült oszlopon kromatografáljuk. Az 35 oszlopot az anyag felvitele után 1,2 liter, 5% metanolt tartalmazó kloroformmal mossuk, a tripeptidet 15% metanolt tartalmazó kloroformmal eluáljuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson desztilláljuk, a desztillációs maradékot éterrel kezeljük, szűréssel elkülönít-40 jük, éterrel mossuk, végül szárítjuk. így 5,82 g súlyú végterméket kapunk; kitermelés: 86%. Elemanalízis a C37

H

36

0

7

N

6

• 2H

2

0— képlet alapján: számított: C 62,35%; H 5,66%; NI 1,79%; 45 mért: C 62,54%; H 5,82%; N 11,43%. Az előállított terméket vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk. A 4. és 3. futtatóeleggyel vizsgálva, szilikagélen 0,63, illetve 0,79 Rr

értékkel jellemezhető egységes foltot kapunk, amely mindkét esetben 50 pozitív Ehrlich- és Pauli-reakciót ad. Szennyeződés jelenlétét nem sikerült kimutatni. 2. A H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OtBu előállítása. 55 50 ml metanolban 3,40 g (5 mmólM) Z— (Pyr)Glu-His-Trp-OBzl-t oldunk, az oldatot palládium katalizátor jelenlétében 4 órán át hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort szűréssel elkülönítjük, a szűrletből a metanolt csök-60 kentett nyomáson eltávolítjuk. A desztillációs maradékot félretesszük. 80 ml metanolban 2,60 g (5 mmólM) Z-Ser-Tyr-Gly-OtBu-t oldunk, az oldatot 1 g palládium katalizátor jelenlétében 3 órán át hidrogénezzük. A 65 katalizátort szűréssel elkülönítjük, a szűrletet csök-