170333. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fenilgilicin optikailag aktív izomerjei előállítáásra
170333 3 4 tartjuk, és a reakciót pufferolt vizes oldatban 7 és 9,5 közötti pH értéken folytatjuk le. A reakcióelegyhez aktiváló vegyületeket, így például mangánsókat és magnéziumsókat is adhatunk. A találmány szerinti eljárás független attól, hogy szabad aminopeptidázt vagy vízoldhatatian aminopeptidázt alkalmazunk. Vízoldhatatian aminopeptidáz alatt olyan aminopeptidázt értünk, amelyet belső térhálósítással (például dialdehiddel), hordozón való adszorpció útján, polimer mátrix segítségével vagy szilárd hordozóhoz való kovalens kötés útján tettünk oldhatatlanná. Mivel az L-fenilglicin csak kis mértékben oldódik vízben, az eljárást híg oldatokban végezzük abban az esetben, ha oldhatatlan enzimet használunk avégett, hogy megelőzzük az L-fenilglicin kikristályosodását az oldhatatlan enzimen. A találmány szerinti eljárásnál mindkét esetben az L-fenilglicint a D-fenilglicinamidtól extrahálással, kristályosítással vagy egy vagy több ioncserélő gyanta segítségével választhatjuk el. Az L-fenilglicint elkülöníthetjük racemizálás nélkül vagy racemizálás után. A DL-fenilglicint valamely sav és alkohol segítségével fenilglicin-alkilészter-sóvá alakíthatjuk, amelyet ammóniával kezelünk, és így DL-fenilglicinamido.t kapunk, amelyet visszavihetünk a folyamatba. A találmány szerinti eljárásnál alkalmazott kiindulási anyagot, amint már említettük, a-amino-benzilcianidból ismert módon, savas hidrolízissel állítjuk elő, így DL-fenilglicinamid-sót képezünk, amelyből a DL-fenilglicinamidot egyenértéknyi mennyiségű bázissal való kezelés útján kapjuk. A találmány szerinti eljárással előállított D-fenilglicin-amidot D-fenilglicin-sóvá hidrolizáihatjuk racemizálás nélkül oly módon, hogy az amidot valamely erős sav, így kénsav, sósav, benzolszulfonsav vagy toluolszulfonsav vizes oldatával együtt melegítjük. A sót ammóniával kezelhetjük, miközben a D-fenilglicin szabad formában kikristályosodik. A találmány kiterjed tehát a D-fenilglicin előállítására szolgáló eljárásra is, amelynek során DL-fenilglicin-amidot valamely megfelelő aminopeptidázzal szelektív módon hidrolizálunk, ezt követően a D-fenilglicinamidot elkülönítjük, és az így kapott amidot D-fenilglicinné vagy ennek savaddíciós sójává alakítjuk. A D-fenilglicint például a-amino-benzil-penicillin előállításánál kiindulási anyagként alkalmazzuk. Az L-fenilglicint például L-aszparagin-L-fenilglicín-metilészter előállításánál használjuk kiindulási anyagként (édesítőszer). Az aminopeptidázt szabad formában vagy vízoldhatatian alakban, például valamely vivőanyaghoz kovalens kötéssel kapcsolódó formában használhatjuk. A találmányt a következő példákon közelebbről is bemutatjuk, de a találmány nem korlátozódik csupán a példákon bemutatott módszerekre. 1. példa 3,0 mg mól (560 mg) DL-fenilglicinamid-hidrokloridot szobahőmérsékleten feloldunk 9,0-es pH-jú puffer-oldatban (1,546 g bórsav, 1,864 g káliumklorid, 0,878 g nátriumhidroxid, 500 ml desztillált vízben oldva) egy keverővel felszerelt reakcióedényben. Az oldathoz hozzáadunk 2,2 ml-nyi 0.125 mólos magnéziumkloridot és 0,1 ml 0,025 mólos mangánkloridot, a pH-t 2,0 ml megközelítőleg 1 n nátriumhidroxidoldattal 8,5-re állítjuk be. Ezután 0,4 mg leucin-aminopeptidázt (80 mg Merck 25 010 enzim-szuszpenzió; sertésveséből) adunk az oldathoz, és az elegyet 5 szobahőmérsékleten és 8,5 pH-n 1,5 óra hosszat keverjük. Vékonyrétegkromatográfiás elemzést végeztünk, vivőanyagként szilikagélt, eluensként pedig (a) szék. butanol, 90%-os hangyasav és víz (térfogatarany: 10 75:17:10) oldószerelegyet, illetve (b) kloroform, metanol, tömény ammónia (térfogatarány: 60:45:20) elegyet alkalmazva. Az (a) esetben kapott Rf érték fenilglicinamidra 0,34 és fenüglicinre 0,25, a (b) esetén fenilglicinamidra 0,91 és fenüglicinre 0,77. 15 A vékonyrétegkromatográfiás elemzés azt mutatja, hogy az L-fenilglicinamid teljesen L-fenüglicinné hidrolizálódott. A reakcióelegy 20 óránál hosszabb reakcióidő után, egy aminosavelemzés szerint, 0,40 súly% L-fenilglicint (hatásosság = 100%) és 0,39 D-fenilgli-20 cinamidot tartalmaz (hozam = 99,5%). 2. példa 32,3 mg mól (6,0 gramm) DL-fenilglicinamM-hid roklorid, 300 mg magnéziumklorid és 1 mg mangán-25 klorid 80 ml vízzel készített oldatának a pH-ját 25 ml közelítőleg 1 n nátriumhidroxid-oldattal 8,1 értékre állítjuk egy keverővel ellátott reakcióedényben. A kapott átlátszó oldathoz hozzáadunk 1,5 mg leucinaminopaptidázt (300 mg Merck 25 010 enzim-szusz-30 penzió), az oldatot szobahőmérsékleten 4 óra hosszat keverjük. A reakció alatt a reakcióelegy pH-ját 1 n sósav és egy önműködő titráló segítségével 8,1 és9,1 érték között tartjuk. Ezen időszak eltelte után a pH-t sósav segítségével 6,5 értékre állítjuk, és utána a 35 reakcióelegyet bepárlás útján (30 C°; 12 Hgmm) 50 ml térfogatra betöményítjük. A kikristályosodott L-fenilglicint szűréssel elkülönítjük. L-fenilglicinkitermelés 2,0 g (hatásosság = 83,3%). A kapott L-fenilglicin fajlagos forgatóképessége: 40 [a]^5 = + 156° (c = 1,6,2,6 súly% sósavban). Beilstein 14 III, 1188 old. szerint fajlagos forgatóképesség: [a]" = + 157,5° (c= 1,6 2,6 súly% sósavban). Az eljárás szelektivitási L-fenilglicinre nézve %-ban: 45 99,5. A szűrlethez 50 ml tömény sósavat adunk, és a D-fenilglicinamid-hidrokloridot, mely kikristályosodik, szűréssel elkülönítjük. A kapott D-fenilglicinamid-hidroklorid mennyisége 50 2,5 g (ez 83,6%-os hozamnak felel meg). A D-fenilglicinamid-hidroklorid moláris forgatóképessége: [M]Q = - 186,5° (c = 0,8, vízben). Beilstein 14 III, 1189 old. szerint a moláris forgatóképesség: 55 [M]g> = -188° (c = 0,8, vízben). Az eljárás szelektivitása D-fenilglicinamid-hidrokloridra nézve, %-ban: 99,5. A keletkező D-fenilglicinamid-hidroklorid 20 ml 6 n sósavval készített oldatát 11/2 óra hosszat forral-60 juk. A reakcióelegyet ezután szárazra pároljuk, és a lepárlási maradékot 20 ml vízben felveszzük. A kapott oldat vékonyréteg-kromatográfiás elemzése azt mutatja, hogy a D-fenilglicinamid teljesen átalakult D-fenilglicinné. Ezután az oldat pH-ját tömény am-65 móniával 6,5 értékre állítjuk, a kikristályosodott ~>
