170262. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az S-adenozil-L-metionin új kettős sóinak előállítására
7 170262 8 H2 S0 4 p-toluolszulfon- SAM sav számított: 20,89%, 36,67%, 41,54%, talált: 20,5%, 36,0%, 41,7%. Karl-Fischer módszerrel meghatározott nedvességtartalom: 1,7-2%. A termék ultraibolya abszorpciós spektrumában 260 nm-nél jelenik meg maximum (El^n = 182). A fenti adatok alapján a termék szerkezete a (II) képletnek felel meg. A (II) képletű új vegyületet a kémiai és fizikokémiai módszereken kívül biológiai úton [nikotinsavamid vagy guanidin-ecetsav enzimes metilezése, lásd: G. L. Cantoni:;J[. Biol. Chem. 189, 745 (1951); G. De La Hóba, B. A. Jamieson, S. H. Mudd és H. H. Richards: J. Am. Chem. Soc. 81, 3975 (1959)} is azonosítottuk. 2. példa Az 1. példában leírt eljárással az ott ismertetett nyersanyagból SAM-ban dús oldatot állítunk elő, és 70 liter így kapott oldathoz 1,15 kg pikrolonsav 10 liter izobutanollal készített oldatát adjuk. Az elegyet éjszakán át állni hagyjuk, majd a csapadékot centrifugálassal elválasztjuk. Az elkülönített szilárd anyagot 9 liter, kénsavra és p-toluolszulfonsavra vonatkoztatva egyaránt 0,1 normál vizes oldat és 9 liter metil-izobutil-keton elegyével kezeljük. Állás után a szerves fázist elkülönítjük, és a vizes fázist a pikrolonsav nyomainak eltávolítása céljából kevés metil-izobutil-ketonnal mossuk. A vizes fázishoz csontszenet adunk, szűrjük, és a szűrletet 70 liter metanolba öntjük. Állás után az oldószert dekantálással eltávolítjuk, és a szilárd anyagot 1,65 kg 15%-os metanolos p-toluolszulfonsav-oldatban oldjuk. Az oldatot csontszénnel derítjük, szűrjük, és a szűrletet 10 liter kloroformba öntjük. Könnyen szűrhető, kristályos csapadékként 1100 g SAM-diszulfát-di-(ptoluolszulfonátot) kapunk. A termék elemzési adatai megegyeznek a 1 .példában közöltekkel. 3. példa Az 1. példában leírt eljárással az ott ismertetett nyersanyagból SAM-ban dús oldatot állítunk elő, és 70 liter így kapott oldathoz 1,15 kg pikrolonsav 12 liter n-butanollal készített oldatát adjuk. Az elegyet éjszakán át állni hagyjuk, majd a csapadékot centrifugálással elkülönítjük. A szilárd anyagot 9 liter, kénsavra és p-toluolszulfonsavra vonatkoztatva egyaránt 0,1 normál vizes savoldat és 12 liter n-butanol között megoszlatjuk. Az elegyet állni hagyjuk, majd a szerves fázist elkülönítjük, és a vizes fázist a pikrolonsav nyomainak eltávolítása érdekében kevés n-butanollal mossuk. A vizes fázist csontszénnel derítjük, szűrjük, és a szűrletet 65 liter n-propanolba öntjük. Az elegyet állni hagyjuk, majd az oldószert dekantálással eltávolítjuk, és a csapadékot 1,65 kg 15%-os metanolos p-toluolszulfonsav-oldatban oldjuk. Az oldatot csontszénnel derítjük, szűrjük, és a szűrletet 14 liter n-butanolba öntjük. 1155 g jól szűrhető, kristályos SAM-diszulfát-di-(p-toluolszulfbnátot) kapunk, amelynek elemzési adatai azonosak az 1. példában közöltekkel. 4. példa A specifikus enzim tisztítása 50 ml Sepharose hordozóanyagot (poliszaccharid, a Pharmacia Fine Chemicals AB cég gyártmánya) 5. vízben szuszpendálunk, és az aminocsoportot tartalmazó vegyületek kötődésének biztosítása érdekében ismert módon brómciánnal kezelünk. Az így előkészített gélhez fölöslegben vett L-lizint adunk. A reakció lezajlása után a gélt desztillált vízzel 8,5 pH-értékű 10 pufferoldattal, majd 4,5 pH-értékű pufferoldattal mossuk, végül 1,5 cm átmérőjű és 30 cm magasságú oszlopba töltjük. Az oszlopon az egyensúlyi állapot beállásáig 0,05 mól trietanol-amint és 0,01 mól kénsavat tartalmazó, 8,0 pH-értékű vizes puferolda-15 tot bocsátunk át. Ezután az oszlopra a specifikus enzimet tartalmazó 2 ml élesztőkivonatot viszünk fel (az élesztőkivonatot ultrahang-besugárzással vagy szárazjeges homogenizálással állítjuk elő, és adott esetben specifikus enzimben dúsítjuk). Az oszlopot ez-20 után a fenti 8,0 pH-értékű pufferoldattal eluáljuk, és ultraibolya spektroszkópiával vizsgáljuk a fehérjék eloszlását az eluátumban. Ugyanakkor J. A. Stekol módszerével [Methods in Enzymology, 6, 566 (1963)] meghatározzuk az egyes eluátumfrakciók 25 szintetáz-aktivitását. A megfelelő szintetáz-aktivitással rendelkező frakciókat egyesítjük. Az így kapott oldat fajlagos aktivitása a kiindulási nyers kivonat fajlagos aktivitásának legalább hússzorosa. Az oldat enzimtartalmát kisózással, szerves oldószeres kicsapással, vagy 30 más, a fehérjeoldatok dúsítására általánosan alkalmazott módszerrel dúsíthatjuk. SAM előállítása 30 ml tömörített Sepharose gélt brómciánnal vagy a fehérjeanyagok kötődését biztosító egyéb kezeléssel 35 aktiválunk, majd az aktivált gélre a fenti módon tisztított és körülbelül 100 mg fehérjét tartalmazó 4 ml specifikus enzimoldatot viszünk fel. Az aktivált gél és az enzimoldat szuszpenzióját 18 órán át 4 C°-on keverjük, majd a gyantát vízzel mossuk. A mosófolya-40 dék enzimaktivitása a specifikus enzimoldat aktivitásának körülbelül 70%-át teszi ki. A fenti módon előkészített Sepharose gélt a korábban ismertetett módon vizsgálva megállapíthatjuk, hogy a gél, aktivitás-egységekben kifejezve, a felvitt enzim körülbelül 45 20%-át köti meg. A fenti módon előkészített Sepharose gélt 1,5 cm átmérőjű és 20 cm magasságú oszlopba töltjük, és az oszlopon 25—27 Cc -on, 5 ml/óra sebességgel literenként 0,675 mól trietanol-amint, 0,150 mól magnézi-50 um-szulfátot, 0,05 mól ATP-t, 0,05 mól metionint és 0,01 mól kálium-kloridot tartalmazó vizes oldatot bocsátunk át. Az oszlopot elhagyó eluátum SAM-tartalmát meghatározzuk. A mérés szerint a reakció 30%-os konver-55 ziófokkal zajlik le. SAM kénsawal és p-toluolszulfonsawal képezett kettős sóinak előállítása 103 ml, literenként 6 g SAM-ot tartalmazó fenti eluátumot kénsawal pH = 3 értékre savanyítunk, és a 60 kapott elegyhez keverés közben 2,3 g pikrolonsav 25 ml metil-etil-ketonnal készített oldatát adjuk. Az elegyet éjszakán át állni hagyjuk, majd a csapadékot leszűrjük és vízzel mossuk. A csapadékot 18 ml, kénsavra és p-toluolszulfonsavra vonatkoztatva egy-65 aránt 0,1 normál vizes oldat és 18 ml metil-etil-ketonf 4
