170194. lajstromszámú szabadalom • Kompozíció és eljárás koleszterin összmennyiségének meghatározására
170194 koleszterinésztereket alkoholos kálium-hidroxidoldattal végzett inkubálás útján elszappanosítják, majd a szabad koleszterint petroléterrel extrahálják. Az elkülönített szabad koleszterint ezután spektrofotometriásán határozzák meg módosított Lieber. mann-Burchard-reagenst (ecetsavanhidrid, kénsav és ecetsav elegye) használva. Ez a szabványosított módszer és számos más ismert módszer közös hátránya a klinikai gyakorlat szempontjából vizsgálva az, hogy mindegyikük igen bonyolult műveleteket igényel, amelyekhez viszont számos reagens szükséges. Ugyanakkor ezek a műveletek meglehetősen hosszadalmasak, így például Abell és munkatársai említett módszerének végrehajtásához, azaz vérszérumban a koleszterin összmennyiségének meghatározásához 2 órára van szükség, míg ugyanezen meghatározást a későbbiekben ismertetett, találmány szerinti eljárást alkalmazva 30 perc alatt el lehet végezni. Mindezeken túlmenően Abell és munkatársai említett módszerének további lényeges hátránya, hogy a meghatározást megelőzően a vérszérumból a teljes koleszterinmennyiséget körülményes és nehézkes extrahálás útján el kell különíteni (a későbbiekben ismertetett, találmány szerinti eljárás esetében erre nincs szükség, vagyis a meghatározás közvetlenül a vérszérumban elvégezhető), továbbá a módszer kivitelezéséhez erősen korrozáv reagensekre van szükség, így biztonsági okokból a módszer csak igen nagy gonddal, üvegből készült kísérleti eszközökben végezhető (ezzel szemben a későbbiekben ismertetett, találmány szerinti eljárás egyszerű műanyag edényekben végezhető). Azt találtuk, hogy a koleszterin összmennyiségének, vagyis a szabad koleszterin és a koleszterinészterek együttes meghatározására szolgáló módszerhez és vizsgálati kompozícióhoz juthatunk a szabad koleszterin és a koleszterinészterek katalizált lebontási reakciói alapján, éspedig oly módon, hogy a koleszterinésztereket koleszterinészter-hidroláz enzimet és adott esetben ezzel az enzimmel együttható epeeredetű faktort használva szabad koleszterinné hidrolizáljuk, a szabad koleszterint pedig oxidatív úton lebontjuk, és a bomlástermékeket ismert módon meghatározzuk. A fentiek alapján tehát a találmány tárgya egyrészt vizsgálati kompozíció koleszterin összmennyiségének meghatározására biológiai folyadékmintákban, például testnedvekben, elsősorban pedig vérszérumban, amely kompozíció koleszterin-oxidázt, adott esetben a folyadékmintával alkotott elegy pH-értékét 5 és 8 között tartó pufferoló anyagot, adott esetben valamilyen baktériumnövekedést gátló anyagot, továbbá hidrogén-peroxid meghatározására peroxidázt és valamilyen redox-indikátort és a találmány értelmében koleszterinészter-hidrolázt és adott esetben a koleszterinészter-hidrolázzal együttható epeeredetű faktort, előnyösen kólsavat, glikokólsavat, taurokólsavat vagy taurodezoxikólsavat vagy ezek valamelyik sóját tartalmazza. Az említett epeeredetű vegyületek előnyösen alkalmazható sói a nátriumsók. A találmány szerinti kompozíció baktériumnövekedést gátló anyagként például nátrium-azidot tartal-5 mázhat. A találmány tárgya ugyanakkor olyan indikátoreszköz is, amelyre jellemző, hogy abszorbens hordozóanyagból, előnyösen nedvszívó papírból, polimer alapú szövetből vagy pórusos műanyagból és a talál-10 mány szerinti kompozícióból áll. A találmány tárgya továbbá eljárás koleszterin összmennyiségének meghatározására biológiai folyadékmintákban, előnyösen vérszérumban. A találmány szerinti eljárás azzal jellemezhető, hogy 15 a biológiai folyadékmintát a találmány szerinti kompozícióval vagy indikátoreszközzel érintkeztetjük, majd a képződött hidrogén-peroxidot kolorimetriásan meghatározzuk. A koleszterin összmennyiségének meghatározása 20 tehát azon alapul, hogy a későbbiekben még részletesebben ismertetendő módon a vizsgált mintában levő szabad koleszterin, illetve a koleszterinészterek hidrolízise útján felszabaduló szabad koleszterin oxidatív lebomlása során képződő hidrogén-peroxidot megha-25 tározzuk. Hidrogén-peroxid mint bomlástermék vizs: gálata során félkvantitatív eredményekhez jutunk abban az esetben, ha a jelentkező kolorimetriás választ vizuálisan értékeljük úgy, hogy szmmintakártyával, vagyis olyan színes csíkok sorozatával hasonlít-30 juk össze, amelyek ismert összmennyiségű koleszterint tartalmazó folyadékminták és a vizsgálati kompozíció érintkeztetése útján kapott színnek megfelelő színűek. Kvantitatív eredményekhez jutunk viszont' ha a jelentkező kolorimetriás választ műszer segítségé-35 vei értékeljük ki. Megjegyezzük, hogy egyébként a szabad koleszterin meghatározható az oxadatív lebomlás során képződő kolesztenonon át is. Az utóbbi esetben a meghatározás vagy azon alapul, hogy a kolesztenon közel 240 mm-en abszorbeál, tehát 40 mennyisége spektrofotometriásán mérhető, vagy pedig azon, hogy a kolesztenon mint egy keton reakcióba lép ismert, ketonokkal szemben reakcióképes kolorimetriás indikátorokkal, így fenil-hidrazin-származékokkal, közelebbről például 2,4-dinitrofenil-hid-45 razinnal hidrazonokat képezve (mindkét meghatározási módszert lásd: Colowick, S. P. és Kaplan, N. O.: Methods in Enzymology, .3. kötet, 392-394. o.; a könyv az Academic Press newiyorki, amerikai egyesült államokbeli kiadó gondozásában 1957-ben jelent 50 meg). Látható tehát, hogy a találmány szerinti eljárás aktív vagy kvantitatív jellege az alkalmazott értékelési módszer pontosságától függ. Mint említettük, a szabad koleszterin bomlásakor hidrogén-peroxid képződik molekuláris oxigén és 55 koleszterin-oxidáz jelenlétében. A szabad koleszterinnek koleszterin-oxidáz jelenlétében végbemenő oxidációs reakcióját, valamint a képződött hidrogén-peroxid meghatározására szolgáló reagensrendszert az alábbi egyenletekkel próbáljuk közelebbről megvilágí-60 tani: szabad koleszterin + 02 •*• A4 - kolesztén-3-on indikátoranyag + H2 0 2 - *• oxidált indikátor (színváltozás) 2
