170149. lajstromszámú szabadalom • Eljárás parvulin-antibiotikumok kinyerésére és tisztítására

3 170149 4 téből kalcium-klorid vagy kalcium-nitrát hozzáadásával kalciumsó formájában igen jó hozammal ki lehet sózni, amennyiben a kisózó kalciumsók koncentrációja az oldatban lo *-nál nagyobb. A kisózást 7,o pH-n célszerű végezni mintegy 6o í-os kalcium-klorid vagy 8o #-os kalcium-nitrát koncentráció megvalósításával ugy, hogy a pH-t utólag ammónium-hidroxid-oldattal 6,5-re állitjuk. Ezzel a müvelettel nemcsak a parvulin jó hozamú kisózásos izolálása oldható meg, hanem egyidejűleg a parvulinok kémiai reakcióval a kivánt kalciumsóvá is átalakíthatók. A fenti átalakítás bármely vizben oldódó kalciumsóval végrehajtható. A parvulin-kalciumsók leválasztását vivőanyagok /pl. buzakorpa/ jelenlétében is végezhetjük. A nyers sók közvetlenül; például állattakarmányba keverve felhasználhatók. Felmerülhet azonban igény ezek tisztítására /koncentrálására/. A találmány további tárgya a nyers parvulin tisztitása, amely azon a felismerésünkön alapul, hogy a parvulinok kalciumsói kalcium-kloridot mintegy l-lo #-ban, előnyösen 2-5 % közötti koncentrációban tartalmazó vizmentes 1-4 szénatomszámú alkoholban jól oldódnak. A kalcium-klorid hatására bekövetkező oldhatóságnövekedés mintegy 25-szörös. Az oldódás nagyarányú megnövekedése komplex-képződésre vezethető vissza, de igen meglepő, hogy ilyen nagy molekulasúlyú kalciumsóknál is végbemegy. A parvulin-komplex alkoholos oldataiból az idegen szennyezések, igy például a sók és fehérjék szűréssel eltávolíthatók, mig a parvulinok kalciumsója a szürletből vizzel vagy oldószer eleggyel kinyerhető. Eljárásunk bármely egyéb módon készült nyers parvulinsó, például ammónium- vagy alkáliföldfémsó vagy parvulinsav tisztítására is alkalmas. A fentiek alapján a találmány eljárás parvulin-antibiotikumok kinyerésére erjesztéses oldatból kalcium-só alakjában és/vagy tisztítására parvulinsav- vagy - sók oldása, majd az oldatból való kicsapása utján, amely abban áll, hogy a kiindulási anyagként használt parvulinokat tartalmazó erjesztéses oldat pH-ját tömény ammónium-hidroxid-oldattal 8,5-9,5-re állitjuk, a micéliumot szűréssel eltávolitjuk, az igy kapott oldat pH-ját o,l-5 n vizes savoldattal, előnyösen 2 n vizes sósav-oldattal 6,5-7,0 értékre állitjuk, majd o,l-l,2 sulyrész kalcium-sót, előnyösen o,6 sulyrész kalcium-kloridot adunk az oldathoz és az igy kapott szuszpenzióból a parvulinok kalcium-sóját szűréssel elkülönítjük és/vagy a terméket olyan 1-4 szénatomszámu vizmentes alkanolban oldjuk, mely l-lo f> kalcium-sót, előnyösen 2-5 i> kalcium-kloridot tartalmaz, a kapott oldatból a kivált szennyező anyagokat szűréssel eltávolitjuk és a kapott szürletből a kivánt végterméket vizzel vagy 7:3 arányú aceton-viz eleggyel kicsapjuk, vagy az alkanol lepárlása után nyerjük. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatositási módja szerint az erjesztéses oldat pH-ját valamely alkálifém-hidroxiddal vagy ammónium-hidroxid-oldat hozzáadásával 9 körüli értékre állitjuk be keverés közben. Az igy képződő parvulinsók vizben jól oldódnak, és az erjesztéses oldat szűrés után mintegy 95 #-ban a szürletben található. A szürlethez annak térfogatára számolva lo #-nál nagyobb koncentrációban, például 6o-7o suly$ vizmentes technikai kalcium-kloridot vagy mintegy 8o $ kalcium-nitrátot adagolunk, majd a pH-t 6,5-re állitva a kisózott parvulin-kalciumsókat a tömény oldatból szűréssel elkülönítjük, és vizes acetonnal, majd acetonnal mossuk, szükség esetén például szén-tetrakloridban szuszpendálva zsirtalanitjuk. A szürlet az eredeti 3ooo-5ooo mcg/ml parvulin koncentrációból mintegy 15-2o mcg/ml-t tartalmaz kisózás után. Ily módon az elkülönített nyers parvulin-kalciumsók izolálási hozama 82-85 % az eredeti fermentiere számolva. Az igy kapott nyers parvulin-kalciumsó keveréket mintegy négyszeres.-tizszeres térfogatú, előnyösen 2-5 % kalcium-kloridot tartalmazó abszolút metanolban vagy etanolban szuszpendáljuk, majd 1 órás intenzív keverés után a szuszpenziót leszűrjük. Az oldhatatlan maradékot metilalkohol-5 lal szuszpendáljuk, majd szűrjük. Az egyesitett szürleteket keverés közben mintegy ötszörös térfogatú vizbe öntjük, majd 1 órás keverés és 1 órás állás után szobahőmérsékleten a kivált tisztitott parvulin-kalciumsókat szűrjük és vizben, majd acetonban szuszpendálva mossuk. •0 A találmány szerinti eljárás további előnyös foganatositási módja szerint ugy járunk el, hogy a kalcium-kloridos alkoholban oldhatatlan anyagok kiszűrése után a szürletét 5o C° alatti fürdőhőmérsékleten vákuumban oldószermentesitjük, a visszama-1g radő szirupot vizben szuszpendáljuk, majd acetont adunk hozzá /a viz-aceton aránya 3:7/. Az igy kivált parvulin-kalciumsót 5 C alatti hőmérsékleten kb. 8 órán át állni hagyjuk, majd szűrjük, és 7:3 arányú aceton-viz eleggyel, majd acetonnal mosva vákuumban megszárítjuk. Ugy is eljárhatunk, 20 hogy a kalcium-kloridos alkoholban oldhatatlan anyagok kiszűrése után a szürletét 5o C° alatti fürdőhőmérsékleten vákuumban oldószermentesit jük, majd a visszamaradó szirupot a nyers termék súlyára számitott 0,6-1,5 térfogatú vizben szuszpendálva nyerjük a _- parvulinok tisztitott kalciumsóját. Mindhá/-a

rom tisztítási változatnál igen jók a hozamok: 7o-85 $-os hozammal kapunk parvulin-kalciumsó elegyet. A találmány szerinti eljárás előnyeit az alábbiakban foglaljuk össze: Eljárásunk nem igényli a parvulinok er-30 jesztéses oldatokból történő oldószeres extrahálását. Igy butanol egyáltalán nem, aceton pedig csak kevés szükséges a végtermék kinyeréséhez, és az oldószerek hosszadalmas regenerálása is elmarad. Ugyanakkor a parvulinsók hozama mintegy 5o $-kal nagyobb, mint az eddig ismert módszerek esetében. Tiszti-35 tási eljárásunkkal lo-15 % parvulin-tartalmu nyers termékből is egy lépésben 7o-85 $-os hatóanyag-tartalmú parvulin-kalciumsókat lehet előállítani 7o-85 % körüli hozammal. Eljárásunk bármely egyéb módon készült nyers parvulinsav vagy -só, például ammónium-, alkálifém-, vagy alkáliföldfém-só tisztitá-4U sara is alkalmas. A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi kiviteli példákkal szemléltetjük. 1. Példa loo liter 5ooo mcg/ml biológiai aktivitású üzemi parvulin erjesztéses oldat pH-45 ját tömény ammónium-hidroxid-oldattal 8,9-re állitjuk, majd ezen a pH-n 1 órán át keverjük. A micéliumot ezután szűréssel eltávolitjuk, majd lo liter vizzel átmossuk. Az egyesitett szürletek. a fermentlé eredeti parvulin-tartalmának mintegy 95 5?-át tartalmazzák. A pH-t ezután keverés közben 2 n só-50 savval 7,o-ra állitjuk, majd 6o kg technikai kalcium-kloridot /82-86 % kalcium-klorid-tartalmu/ adunk hozzá keverés közben. A kalcium-klorid oldódása folyamán az oldat 5o-6o C°-ra felmelegszik, és a pH'kb. 4-re áll be, amit tömény ammónium-hidroxid-ol,-(- dattal 6,5-re módosítunk. A kisózott parvu-' 00 lin-kaleium-sót az oldattól szűréssel elkülönítjük. A szürlet gyakorlatilag nem tartalmaz értékes parvulint. A parvulin-kalcium-sót egy-egy., majd 7:3 arányú aceton-viz eleggyel, majd vizmentes acetonnal mossuk, 25 C°-on szárítjuk, végül széntetrakloriddal 60 szuszpendáljuk a fermentáció zsiros anyagainak eltávolítása céljából, majd ezt követően ismét szárítjuk az anyagot. Termék: 25oo g, mely a fermentlé parvulin-tartalmának 85 'A-át tartalmazza. Parvulin-tartalom /biológiai értékmérés alapec ján/: 16,5 *. 65 A biológiai értékmérés B.subtilis ATTC 6633 jelzésű törzzsel történt /Horváth, I. wíx, Gy.: Acta Physiol. Hung. 4. 435 /1953//. 2