170134. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás vinblasztin-dez-n-metil-vinblasztin és vinkrisztin tisztítására

5 170134 6 A megmaradt oldat pH-ját 4,2-re állítjuk be, 3 #-os alkoholos kénsav oldattal. A megmaradt alkaloidok szulfát-sói azonnal tükristályként kiválnak - a kristályosítást még két napon keresztül folytatjuk. A kivált kristályokat centrifugálással elkülönítjük, etanollal mossuk és szárítjuk. A kitermelés 241 rag vinblasztin-szulfát- és vinkrisztin-szulfát só elegye, mely még kis mennyiségű leurozin-szulfátot is tartalmaz. A sókat a vonatkozó szabad bázisokká alakítjuk oly módon, hogy a sókat vizben feloldjuk. A vizes oldat pH-ját 8,o-ra állítjuk be 14 n ammónium-hidroxld hozzáadásával, majd a vizben nem oldódó bázisokat metilén-kloriddal extraháljuk. A metilén-kloridos extráktot leszűrjük és az oldószert vákuum-bepárlással eltávolítjuk. Az igy nyert maradékot 4oo g aluminiumoxidon /aktivitás: III, 2oo rf/g/ kromatografáljuk, metil-aoetát - metilén-klorid - viz /48:51:1/ oldószer elegyet használva eluensként. A kromatografálást rozsdamentes acél kolonnában végezzük, melynek átméróje 8 mm, magassága 7 m, a nyomás 18-23 kg/cnf. Az aluminiumoxid-töltet arány megközelítőleg 2ooo/l. Az eluátum ellenőrzését 254 m ,u hullámhossznál végezzük és a frakciók elkslönitése a csúcsoknak az ultraibolya tartományban történő megfigyelésén alapul. A túlnyomórésztüeurozint, vinblasztint, dez-N-metil-vinblasztint és vinkrisztint tartalmazó frakciók azonositása vékonyrétegkromatográfiával történik. A vinkrisztint tartalmazó frakciókat összegyűjtés után szárazra pároljuk, s ily módon 18,7 mg alkaloidot kapunk. Ezt a bepárlási maradékot 2o ml abszolút alkoholban feloldjuk, a nem oldódó részt centrifugálással elkülönítjük. Az oldat pH-ját 3 #-os alkoholos kénsav oldattal 4,2-re állitjuk be, s igy vinkrisztin-szulfátot kapunk. A kristályosodó elegyet szobahőfokon állni hagyjuk két napig. A vinkrisztin-szulfátot centrifugálással elkülönítjük. Az igy nyert anyagot etanollal mossuk, majd szárítjuk. A termék 95 1> tisztaságú. Op: 273-281 0°, / /_ = +8,5°. Az igy nyert vinkrisztin mennyisége: 12,3 mg /ez 14,1 mg/kg extrahált ievél - mennyiséggel egyenértékű/. Az igy előállított vinkrisztin-szulfát tulajdonságai az irodalomban leírttal azonosak. Egy másik eljárásváltozat szerint: lo g VRA-t 5 térfogatrész abszolút alkoholban oldunk fel. Az oldat pH-ját 4,2-re állitjuk be, 3 í-os alkoholos kénsav oldattal. A szulfátsó elegyet beoltjuk vinblasztin-szulfátra. A kristályosodó elegyet 48 óráig állni hagyjuk, majd a dimer alkaloid-szulfát elegyet centrifugálással elkülönítjük. Ezután a fent leírtak szerint járunk el és a gélkiszoritásos kromatografiát követően, dezaktivált aluminiumoxidon végzett nagynyomású kromatográfiai alkalmazunk. Ily módon 2o,6 mg vinkrisztint nyerünk, mely 11,8 mgAg extrahált levél-menynyiséggel egyenértékű. Aluminiumoxidon végzett nagynyomású kromatográfia alkalmazása révén az eluátum egyes alkaloidban gazdag frakcióiból hasonló módon állitható elő vinblasztin, leurozin, vinkrozidin, dez-N-metil-vinblasztin és a többi dimer alkaloid, szabad bázis vagy szulfát-só alakjában. 2. példa Vinblasztin tisztítása Az 1. példában leirtak szerint járunk el. Az aluminiumoxidon végzett nagynyomású kromatográfoszlopról lejövő frakciók közül vékonyrétegkromatográfiával azonositjuk azokat, amelyek túlnyomórészt vinblasztint tartalmaznak. A frakciókat összegyűjtjük, majd ezeket vákuumban szárazra pároljuk. A kapott maradék túlnyomó részt vinblasztint és kis mennyiségben leuroziht tartalmaz. Ezt a maradékot metanol-etanol /1:1/ elegyben oldjuk. A leurozin oldhatatlan ebben az oldószer elegyben, s igy kiválik. A leurozint centrifugálással elkülönítjük. A megmaradt oldat tartalmazza a vinblasztint. Ennek pH-ját alkoholos kénsav oldattal 4 és 5 közöttire állítjuk be. Ily módon a vinblasztin és a többi jelenlevő dimer g alkaloid szulfát sóvá alakul. A szulfát sókat szűréssel elkülönitjük, a szürletet eltávolítjuk. Ezután a szulfátokat a szokásos módon szabad bázissá alakítjuk. A szabad bázisokat- aluminiumoxidon /aktivitás: 111/ újra kromatografáljuk. Az aluminiumoxid-töltet súlyarány 6o:l, mozgó fázis-10 ként benzol-kloroform /1:1/ elegyet használunk. A kapott frakciók csupán vinblasztint tartalmaznak, egyéb dimer alkaloid nélkül /az azonosítás vékonyrétegkromatográfiával történik/. A vinblasztint tartalmazó frakciókat egyesitjük és az oldószert ezekből vákuumban eltávo«c lit juk. A maradék vinblasztint metanolos oldatból ujrakristályositjuk. Ily módon tisztított vinblasztint nyerünk, melyet etanolban feloldunk és az oldatból alkoholos kénsav hozzáadásával a szulfát sóját állitjuk elő. Tisztasága: 94 *. Op. 284-285 C° /bomlás/, / /|5 = _28°. 20 Az igy nyert vinblasztin-szulfát a vékonyrétegkromatográfoh jellemző foltként jelentkezik. 3. példa Dez-N-metil-vinblasztin átalakítása vlnkrisztlhné . Kétszázhetven kilogramm száraz Catharanthus roseus levelet az 1. példában leirtak szerint kezelünk. 30 A nagynyomású kromatográfiás lépésben kapott frakciók közül azokat, amelyek dez-N-metil-vinblasztint tartalmaznak vékonyrétegkromatográfia segítségével azonositjuk. Ezeket a frakciókat vákuumban szárazra pároljuk. Az igy kapott 7,73 gramm nyers dez-N-metil-vinor blasztint a Gorman által ismertetett módszer J0 szerint

/3 354 163 számú USA szabadalmi leirás/ vinkrisztinné alakitunk. Ugy járunk el, hogy az anyagot hozzáadjuk 927 ml 98 5í-os hangyasavat és 154 ml ecetsavanhidridet tartalmazó oldathoz. Miután a. reakció - melyet vékonyrétegkromatográfiával követünk - teljes 40 mértékben lejátszódott, a reakcióelegyet vákuumban szirupsürüségig bepároljuk. A koncentrátumot loo ml vizben oldjuk fel. Az alkaloidokat szabad bázissá alakitjuk oly módon, hogy a vizes oldatot 5,8 pH értéken metilén-kloriddal háromszor extraháljuk. Az összegyűjtött metilén-kloridos extraktokat 4o vákuumban bepároljuk. Ily módon 7,84 gramm vinkrisztint kapunk szabad bázis alakjában. A szabad bázist tovább tisztítjuk nagynyomású /14,3-21,4 kg/cnf/ folyadék kromatográfiával, 2,5x73o cm méretű rozsdamentes acél kolonnát használva, 32oo g III-IV-es ak-50 tivitásu neutrális alumíniumoxid adszorbens alkalmazása mellett. A mozgó fázis etil-acetát: metilén-klorid: viz /25:75:o,4/ elegye. Azoknak a frakcióknak a szárazra párolása után, amelyek túlnyomó részt vinkrisztint tar' talmaznak - 2,64 g anyagot nyerünk. Ezt azután etanolos oldatból kétszer kristályosit-55 _juk, majd újra kromatografáljuk - metil-acetát: metilén-klorid: viz /48:51:1/ elegyet alkalmazva mozgó fázisként. Ezután metanolos oldatból kikristályositjuk, majd etanolos oldatban szulfát sóvá alakitjuk. Igy 1,4 g vinkrisztin-szulfátot kapunk, mely 5,3 mg/kg 60 extrahált levélmennyiséggel egyenértékű. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás dimer indol alkaloidok - vinkrisztin, dez-N-metil-vinblasztin és vinblasztin - tisztítására, melynek során a fenti alkaloidokat tartalmazó növényt savval extra-