170113. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú bakteriális alfa- amiláz és/vagy semleges proteáz, valamint lúgos proteáz előállítására

7 170113 8 proteáz aktivitása 3o mE/ml/ használunk. így az ioncserélő gyanta kötőképessége 4oo mE/ml. 8./ Az 1. példa alapján célszerűen veszünk 6 liter alfa-amiláz neutrális proteáz fermentlevet, melynek térfogatára számitva 3 $ kalciumkloridot keverünk be. 1,5 órát állni hagyjuk +4 C°-on, majd a kivált csapadékot kicentrifugáljuk. Az éles szürlet pH-ját 2 M pH = 3,5 nátrium-acetát-ecetsav-pufférrel 5,2 értékre állítjuk. Az igy előkészített fermentlé 57oo E/ml amilázt és 2o mE/ml proteázt tartalmaz. A nátrium formában levő ioncserélő gyantából egy 4 cm ^-jü és 27 cm magas oszlopot készitünk /térfogata 339 en?/. Az oszlopot o,l M pH = 5,2 foszfátpufférrel egyensúlyba hozzuk. Az oszlopon 5 liter előkészített fermentlevet o,66 ml/perc/cn? sebességgel +4 C°on átengedünk. Az átfolyt fermentlé 15o E/ml amilázt és 3 mE/ml proteázt tartalmaz.így a kötődés az ioncserélő oszlopon 96 #-os amilázra és 85 $-os neutrális proteázra számítva. Az eluciót pH = lo,o-en o,3 M ammóniás pufférrel végezzük, a szorpciőhoz hasonló sebességgel. Az első 4oo ml után levesszük a fŐfrakciőt 35o ml-es térfogatban. /Az eredeti fermentlé térfogatához viszonyítva 14-szeres a térfogatcsökkenés./ A főfrakciót azonnal kicsapjuk +4 C°-on háromszoros térfogatú izopropanollal. 1-2 órás állás után a kiülepedett csapadékot kiszűrjük, majd kevés hideg vízmentes alkohollal átmossuk és légáramban szárítjuk. 9 g port kapunk, amely 3ooo E/mg aktivitású amilázra és 8,4 E/g proteázra vonatkoztatva. Az előkészített fermentiere számitva a termelés: amilázból 95 *, proteázból 8o %. 9./ Minden a 8. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a fermentlevet Ca-foszfát gél képzése nélkül centrifugáljuk, igy a fermentlé 684o E/ml alfa-amilázt, 24 mE/ml neutrális proteázt tartalmaz. Az előkészített oszlopon 42oo ml fermentlevet engedünk át és feldolgozás után 9,4 g port kapunk mely 28oo E/mg aktivitású alfa-amilázra és 9 E/g aktivitású neutrális proteázra vonatkoztatva. Az előkészített fermentiere számitva az am iláz kitermelés 91 *, a neutrális proteáz kitermelés 84 •£. lo./ Mindenben a 8.példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a 7.példa szerint elŐállitott 6 liter lúgos proteáz tartalmú fermentlebe o,8 < dinátriumhidrogénfoszfátot és 1,2 i> trinátriumfoszfátot keverünk. Az igy előkészített fermentlé 26 mE/ml alkalikus proteázt tartalmaz. 8 g enzimport kapunk, melynek proteolitikus aktivitása 13 E/g. A termelés a szűrt fermentiere 8o <. 11./ Mindenben a 8. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a 7. példa szerint előállitott lúgos proteázt tartalmazó fermentlevet használunk és azt kalciumfoszfát gél képzése nélkül centrifugáljuk. Igy a fermentlé 29 mE/ml lúgos proteázt tartalmaz. Az előkészített oszlopon 42oo ml fermentlevet engedünk át. 8,5 g port kapunk, melynek aktivitása 12,5 E/g. A kiindulási anyagra vonatkoztatott termelés 87,5 *• 12./ Az ioncserélő gyantáról leoldott 25o ml oldatot közvetlenül /amiláztartalma 33oo E/ml, proteáz tartalma o,12 E/n.l, pH = 7,3/ átfolyatjuk loo ml belső térfogatú OH-formára aktivált dietilamino-etilcellulóz oszlopon, melyet azután vizzel átmosunk. Az átfolyó lé és a mosófolyadék egyesítéséből összesen looo ml oldatot gyűjtünk. 2,5 g kalciumklorid hozzáadása után az oldat pH-ját 7,5-re állítjuk, majd azonos térfogatú etanollal hidegen /+4 C°-on/ kicsapjuk az amilázt. A csapadékot másnap elkülönítjük és desztillált vizes oldás után fagyasztva száritjuk. Az igy kapott 75o mg termék amiláz aktivitása 73oo E/mg és kitermelése 66,4 £; proteáz aktivitása o,4 E/g és kitermelése 1,0 •&. A visszamaradt felüluszóhoz ismét looo ml etanolt adunk, másnapig állni hagyjuk, majd a kivált proteáz- és amiláztartalmu közti terméket elválasztjuk. Desztillált vizes feloldás után fagyasztva száritjuk. Az igy kapott 612 mg termék amiláz aktivitása 115o E/mg és kiter-4 melése 8,6 $, proteáz aktivitása 5,1 E/g és kitermelése lo,2 <• A közti termék elválasztása után kapott felüluszóhoz 2ooo ml hideg etanolt adva kicsapjuk a proteázfrakciót. Ezt is desztillált vízben visszaoldjuk, majd fagyasztva száritjuk. Az igy kapott 1248 mg termék proteáz aktivitása 18,1 E/g és termelése 75 *; amlláz aktivitása nincs. 13./ A 8. példa alapján előállitott 4 g sötétbarna szinü, amiláz-proteáz tartalmú terméket /amlláz aktivitása 2ooo E/mg, proteáz aktivitása 6,o E/g/ feloldunk loo ml desztillált vizben /pH ='7,2/. Az oldatot átengedjük 75 ml belső térfogatú, előzetesen OH-formára aktivált, majd desztillált vizzel kimosott dietilamino-etil cellulóz oszlopon. Az osSlopüres térfogatának megfelelő kb. 5o ml folyadékot elöntjük, majd a további átfolyó részt gyűjtjük, végül az oszlopot desztillált vizzel alaposan átmossuk, összesen 5oo ml átfolyó és mosófolyadékot gyűjtünk, amely világos halványsárga szinü. Az átfolyó folyadék o-15o ml részletének pH-ja 9,8, 15o-4oo ml részletének pH-ja 8,4, 4oo-5oo ml részleténekpH-ja 8,2; az egyesített folyadék pH-ja 8,5. Ehhez az oldathoz 2,5 g kalciumkloridot adunk, majd annak feloldása után lehűtjük 0 C°-ra. Ezután keverés közben 5oo ml hűtött etanolt adunk hozzá és másnapig állni hagyjuk +4 C°-on. A keletkezett üledéket kicentrifugáljuk és desztillált vizben feloldva, fagyasztva száritjuk az amilázfrakciőt. A kapott termék 7oo mg fehér por, amiláz aktivitása 844o E/mg és kitermelése 74 $>, proteáz aktivitása o,6 E/g és kitermelése 1,7 *. Az előbbi felüluszóhoz hidegen, kevertetés közben ismét 5oo ml etanolt adunk, majd másnapig állni hagyjuk. A csapadékot centrifugálva desztillált vizben oldjuk és fagyasztva száritjuk. Ez a 35o mg halványsárga poralaku termék proteáz-amiláz keverék. A termék amiláz aktivitása 177o E/mg, és kitermelése 7,7 t, proteáz aktivitása 6,3 E/g és kitermelése 9,2 ¥>. Az előző csapadék elválasztásánál kapott felüluszóhoz kevertetés közben looo ml hűtött etanolt adunk,majd 0 C° hőmérsékleten másnapig állni hagyjuk. A A kivált csapadékot centrifugálással elkülönítjük, majd desztillált vizben feloldva, fagyasztva száritjuk. A 78o mg proteáz frakció amiláz aktivitása 26 E/mg és kitermelése o,2 *, proteáz aktivitása 19,5 E/g és kitermelése 62,5 #• Ha a megmaradt felüluszóhoz további looo ml hűtött acetont adunk és egy éjszakán át állni hagyjuk, a csapadékot centrifugáljuk és desztillált vizes beoldás után száritjuk, akkor további proteáz frakciót kaphatunk. Ennek súlya 25o mg, proteáz aktivitása 2o,o E/g és kitermelése 2o 4,. 14./ A lo. példa alapján előállitott loo g nyers, szürkésbarna szinü, alkalikus proteáz tartalmú terméket, amelynek aktivitása 12 E/g, 5oo ml vizben, melynek pH-ját előzőleg 8,5-re állítjuk, feloldunk. Az esetleges nem oldódó részt centrifugálással eltávolítjuk. A tiszta oldatot átengedjük egy 5oo ml belső térfogatú, előzetesen OH formára aktivált, majd desztillált vizzel kimosott dietilamino-etil cellulóz oszlopon. Az oszlop üres térfogatának megfelelő kb. 35o ml folyadékot elöntjük, majd a további átfolyó részt gyűjtjük, végül az oszlopot desztillált vizzel alaposan átmossuk. Igy összesen 25oo*ml átfolyó és mosó folyadékot gyűjtünk, amely halványsárga szinü. Az egyesitett folyadék pH-ja 8,9. Az oldathoz 5o g kalciuntkloridot adunk, majd annak feloldása után lehűtjük +4 C -ra. Ezután keverés közben 5ooo ml hűtött etanolt adunk hozzá és másnapig állni hagyjuk +4 C°-on. A keletkezett üledéket centrifugáljuk és desztillált vizben beoldva fagyasztva száritjuk. A termék 54 g szürkés por, proteáz aktivitása 2,5 E/g, kitermelése 11 %. Az előbbi felüluszóhoz hidegen kevertetés közben 5ooo ml etanolt adunk, majd ismét másnapig állni hagyjuk. A csapadékot centrifugálással elkülönítjük, desztillált vizben oldjuk és fagyasztva száritjuk. A kapott világos szinü termék súlya 35,6 g; proteolitikus aktivitása 22 E/g, kitermelés 65 H>. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60