170109. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és eszköz koleszterinoxidáz aktiválására, kimutatására és meghatározására

5 170109 6 indikátort tartalmaz, adott esetben higitóanyagokkal és/vagy stabilizátorokkal együtt. Szérumkoleszterin kimutatására rendkivül alkalmasak a megfeleli reagensekkel impregnált szivóképes papirokból készült teszt-lapok. Ha a koleszterint a teljes vérben kivánjuk kimutatni, ugy a teszt-papirokat célszerűen például a DT-OS 1 598 o48 számú Hémet Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali iratban leirt módon hidrofóbbá kell tennünk, vagy cellulóz-észterekből vagy hasonlókból álló féligáteresztő hártyával kell bevonnunk. A teljes vér koleszterinjének kimutatására különösen alkalmasak a DBP 1 598 153 számú Hémet Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leirás szerint elkészitett teszt-filmek. Előállításukhoz a reagenseket, például koleszterinoxidázt, peroxidázt, puffert, indikátort és adott esetben higitóanyagokat a találmány szerint hozzáadott felületaktív anyagokkal együtt filmképző polimer vizes diszperziójához adjuk hozzá. Ezt a diszperziót vékony filmmé kenjük szét és megszárítjuk. Ha az ilyen reagensfilmre koleszterintartalmú vért csepegtetünk és mintegy 1 perc múlva letöröljük, szineződést kapunk, melynek erőssége a koleszterin mennyiségétől függ. A színeződés fotométerrel mennyiségileg értékelhető. A találmány szerinti diagnosztikai eszköz szabad koleszterin kimutatására és meghatározására alkalmas. Ha koleszterinészterek is jelen vannak, ugy ezekből a koleszterint előbb szabaddá kell tenni. Ez szokásos módon, például vizes lúggal történő elszappanositással hajtható végre. Különösen előnyös azonban a koleszterinészterázzal való észterhasitás /ami előnyösen mikroorganizmusokból izolálható/, mivel ilyenkor igen kiméletes körülmények között dolgozhatunk. A koleszterinészterázt a testfolyadékhoz adjuk hozzá és bizonyos ideig inkubáljuk. Ezt az eljárást például ugy hajthatjuk végre, hogy a testfolyadékot olyan kapillárisokba szívjuk fel, melyeknek belső falát - a DBP 2 24o 672 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leirás szerint - koleszterinészterázzal és esetleg segédanyagokkal vontuk be. A kapillárisokban való inkubálás után a folyadékot a fent leirtak szerint a teszt-csikokra visszük fel. Ha a testnedvben eredetileg szabad és észterezett koleszterin együtt fordul elő, ugy természetesen a kettő összegét mutatjuk ki. Igen előnyös azonban, ha a koleszterinészterázt a teszt-esikokba dolgozzuk be, mivel igy olyan diagnosztikai eszközhöz jutunk, amellyel egy lépésben tudjuk kimutatni, illetve meghatározni a szabad és az észterezett koleszterin együttes mennyiségét. A koleszterin oxidációjánál képződő hidrogén-peroxid kimutatására alkalmas rendszerek - előnyösen peroxidáz, puffer, oxidációs indikátor és adott esetben higitóanyag, stb. - ismeretesek például a glükóz gyorspróbájának leírásából. Ezen előnyben részesített renszer alkotórészei például a következők: A peroxidázok közül különösen a tormából nyertek alkalmasak, de laktoperoxidáz és hasonlók is használhatók. Pufférként például foszfát-, citrát- vagy borátpuffer jön tekintetbe. A pufferok a diagnosztikai eszközt 4-9, előnyösen 5-8 pH-értékre állítják be. Oxidációs indikátorként különböző vegyületosztályok jönnek szóba, éspedig benzidinszármazékok, mint például o-toluidin, o-vanillin-származékok a DT-AS 1- 598 133 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leirás, vagy heterociklusos azinok a DT-AS 1 648 84o számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leirás szerint. A diagnosztikai eszközök, különösen a tesztfilmek recepturajához még szokásos higitóanyagok, mint nátrium-alginát, karboxi-metil-cellulóz, stb., továbbá enzim-stabilizálők, például ditio-eritrit is hozzáadhatok. A teszt-filmek alapanyaga műanyag-diszperziókból, például polivinil-propionát- vagy acetát.diszperzióból áll. Az összes reagenst - előnyösen oldat formájában - ebbe keverjük bele, a keveréket vékony filmmé kenjük ki és megszárítjuk. A teszt-papirokat ugy állitjuk elő, hogy c a reagenseket vizben vagy viz és szerves ol-0 dószerek elegyében oldjuk, az oldattal szűrőpapírt impregnálunk és megszáritjuk. Ugy is eljárhatunk, hogy a vizoldható reagensekkel a papirt előimpregnál.iuk, majd utóimpregnálást végzünk a szerves oldatban levő indikátorokkal. A következő példák megvilágítják a találmányt. Ijpélda o,45S> hldroxi-polietoxi-dodekánt tartalmazó lo ml o,5M kálium-foszfát-pufférhez /pH 7,5/ o,o5 ml szérumot adunk. Az extinkciót /Ex/ 24o nm-nél alkalmas spektrofotométerben leolvassuk és a reakciót o,o2 ml /= 0,1 egység/ tárolásig -stabil, detergensnyomoktól mentes, 1 M ammónium-szulfát-oldatban oldott koleszterinoxidázzal elindítjuk. 3 perc múlva az extinkciót /Eg/ újra leolvassuk. A képződött kolesztenon és ezzel a koleszterin koncentrációja koncentrációja az első-és a második leolvasás különbségéből adódik, figyelem-20 be véve a kolesztenon moláris extinkciós koefficiensét 24o nm-nél. Jellemző próba mérési eredménye 62 mg56 szabad koleszterin és 167 mg# összkoleszterin /elszappanositás után/. Az összehasonlító meghatározás reakcióideje 25 felületaktív szer hozzáadása nélkül 15 perc. Az enzim tárolhatóságának megjavítása céljából a detergensnyomokat hidrofób gyanta-adszorbensekkel távolítjuk el. Igen alkalmasak erre például a Biorad cég által Bio-Beads néven és a Röhm és Haas' cég által XAD-gyanta néven forgalomba hozott termékek. 30 2. Példa 0,0251 hidroxi-polietoxi-dodekánt és 0,0336 nátrium-dezoxikolátot tartalmazó lo ml o,5M kálium-foszfát-puff érhez /pH 7,5/ o,o5 ml szérumot adunk. Az extinkciót /ET/ 24O nm-nél alkalmas spektrofotométerben leolvassuk és a reakci.,(- ót o,o2 ml /= o,l egység/ tárolás-stabil, detergensnyomoktól mentes, 1 M ammónium-szulfát-oldatban oldott koleszterinoxidázzal megindítjuk. 3 perc múlva az extinkciót /Ej/ újra leolvassuk. A képződött kolesztenon és ezzel a koleszterin koncentrációja a két leolvasás különbsége 40 alapján számitható ki, tekintetbe véve a kolesztenon moláris extinkciós együtthatóját 24o nmnél / = 15,5 ci#/ M/. . Tipikus próba mérése 65 mg* szabad koleszterint és 17o mg?C összkoleszterint ad /elszappanositás után/. 3. példa 45 0,0256 hidroxi-polietoxi-dodekánt és 0,156 szekunder alkil-szulfátot tartalmazó lo ml o,5 M kálium-foszfát-pufférhez /pH 7,5/ o,o5 ml szérumot adunk. Az extinkciót /Ei/ 24o nm-nél alkalmas spektrofotométerben leolvassuk és a reakciót o,o2 ml /= o,l egység/ tárolás-stabil 50 detergensnyomoktól mentes, 1 M ammónium-szulfát-oldatban oldott koleszterinoxidázzal megindítjuk. 3 perc múlva az extinkciót /Ej/ ismét leolvassuk. A képződött kolesztenon és ezzel a koleszterin koncentrációja az első és a második leolvasás különbségéből számitható ki, fi-55 gyelembe véve a kolesztenon moláris extinkciós koefficiensét 24o nm-nél. Jellemző próba mérési eredménye 62 mg5& szabad koleszterin és 167 mg56 összkoleszterin /elszappanositás után/. 4. pe-iaa Szűrőpapírt /Schleicher-Schüll 597 NE Ind/ a következő oldattal átitatunk és 4o°C-on szárítunk: 1 M citrát-puffer pH 5,25 2o ml Kdleszterinoxidáz /60 É/mg/ o,l g 65 Peroxidáz /7ö E/mg/ o,o5 g Desztillált viz loo ml-ig A papirt loo ml metilén-kloridban oldott o,2 3