170109. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és eszköz koleszterinoxidáz aktiválására, kimutatására és meghatározására

MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI 170109 LEÍRÁS Nemzetközi osztályozás G 01 N 33/16 Bejelentés napja: 1974.XII.4. (BO-1525) El sőbbsége: Német Szövetségi Köztársaság 1973. XII.7. (P 23 61 169.0) 1974. VIII.16. (P 24 39 348.4) Közzététel napja: 1976. XI.27. Megjelent: 1977.XI.15. Feltaláló: dr. Roeschlau Peter, vegyész, Lang Gunter, vegyésztechnikus, dr. Beaucamp Klaus, vegyész, Tutzing/Obb, Bernt Erich, gyógyszerész. München, dr. Gruber Wolfgang; vegyész, Tutzing-Unterzeismering Német Szövetségi Köztársaság Tulajdonos: Boehringer Mannheim, GmbH., Mannheim-Waldhof, Német Szövetségi Köztársaság Eljárás és eszköz koleszterinoxidáz aktiválására, kimutatására és meghatározására 1 A találmány tárgya eljárás koleszterinoxidáz aktiválására, kimutatására és meghatározására, és diagnosztikai eszköz az eljárás végrehajtására. A DAS 2 224 132 számú NSZK-beli közzétételi irat eljárást ir le koleszterin meghatározására, melynek során a koleszterint vizes közegben koleszterinoxidázzal inkubálják és/vagy az oxigénfogyasztást, vagy a képződött hidrogén-peroxidot illetve kolesztenont határozzák meg. A fenti közzétételi iratban a koleszterin meghatározására szolgála reagenst is leirják, amely koleszterinoxidázból és a hidrogén-peroxid vagy a kolesztenon meghatározására szolgáló rendszerből áll. Azt találtuk, hogy a koleszterinoxidáz tároláskor nem eléggé stabil és aránylag gyorsan inaktiválódik. Az instabilitás okait vizsgálva megállapítottuk, hogy az inaktiválódást detergensnyomok okozzák,melyek az enzim-kinyerés körülményeiből adódóan az enzimben kisérőanyagként visszamaradtak. Az enzim-kinyerés például a DOS 2 224 131 számú NSZK-beli nyilvánosságrahozatali irat szerint ugy történhet, hogy koleszterint átalakitd mikroorganizmust a sejtfal szétroncsolása utján nem-ionogén felületaktív szert tartalmazó pufferoldattal feltárunk és extrahálunk, a kivonatot centrifugáljuk és a kapott felüluszót ioncserélő oszlopra visszük fel, az enzimet a nem-ionogén felületaktiv szert tartalmazó pufferoldattal eluáljuk és az eluátumból izoláljuk. Azt találtuk, hogy a visszamaradt detergensnyomokat eltávolítva az enzim tárolási stabilitása teljesen kielégitő. Kiderült azonban, hogy a detergensnyomoktól megtisztított enzim aktivitása jelentősen csökken. Ennek következményeként ha az enzimet például koleszterin-meghatározásra használjuk, akkor vagy meglehetősen frissen előállított készítményt kell használnunk, vagy lényegesen nagyobb enzim-meny-10 15 20 25 30 35 nyiségeket kell a próbához alkalmaznunk, vagy a mérési időt kell jelentősen megnövelnünk. Ezért a találmány feladata, hogy a koleszterinoxidáz aktiválására eljárásról gondoskodjék. A találmánynak különösen az a feladata, hogy a fenti célokra olyan eljárást adjon meg, amely egyrészt lehetővé teszi a detergensnyomoktól teljesen mentes és ezáltal tárolásnál kielégítően stabil koleszterinoxidáz használatát, másrészt pedig a felhasználás alkalmával olyan enzimaktivitást biztosit, amely megfelel a frissen előállított, detergensnyomoktól még le nem bontott enzim aktivitásának. Jí találmány szerint a koleszterinoxidáz aktiválására olyan eljárást használunk, melynek során legalább egy, lipofil és hidrofil tulajdonságokkal rendelkező felületaktiv vegyületet adunk használat előtt a koleszterinoxidázhoz. lipofil és hidrofil tulajdonságú felületaktív szerként előnyösen olyan nem-ionogén detergenseket használunk, melyek molekulájukban legalább egy hidroxilcsoportot tartalmaznak. Különösen előnyben részesítjük az alkil-, aril- és aralkil-alkoholok polioxi-etilén-származékait. Ilyen felületaktiv vegyületek például a polioxi-etilén-alkil-éterek, polioxi-etilén-alkil-karbonsav-észterek, polioxi-etilén-szorbitán-alkil-karbonsav-észterek, polioxi-etilén-glicerin-alkil-karbonsav-észterek, polioxi-etilén-alkil-aminok, polioxi-etilén-polioxi-propiléntömbpolimerek, polioxi-etilén-alkil-tioéterek, polioxi-etilén-alkil-aril-éterek. Jellemző példák a hidroxi-polietoxi-dodekán, alkil-fenolok etilén-oxid-adduktumai,szorbitánhidridek po-170109