169981. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hordozóhoz kötött enzimek és/vagy biológiailag aktív anyagok előállítására
169981 6 A monomerek változtatása (maleinsavanhidrid helyett itakonsavanhidfid és citrakonsavanhidrid, sztirol helyett ortometil-sztirol), a legjobbnak talált monomer arányok betartása mellett, a vizsgált enzimek megkötésére nézve lényeges különbséget 5 nem mutatott. Ezenkívül a kopolimereken vizsgáltuk kismolekulasúlyú primer aminocsoportokat tartalmazó 1-arginin, 1-lysin, glükozamin, piridoxamin-dihidroklorid és p-aminofenilmerkuriacetát kovalens megkötését. A kapott eredményeink a 10 számított kötési kapacitást 95-100%-ban megközelíti. Eredményeinket a találmánynak a példákra való korlátozása nélkül az alábbi példákon mutatjuk be. 1. példa 49 g maleinsavanhidrid, 78 g sztirol, 21,5 g metakrilsav, 0,74 g 63%-os divinilbenzol és 1,77 g 20 benzoilperoxid keverékét 382 g toluolban 3 órán át 80C°-on kevertetjük, majd ezen a hőmérsékleten tartjuk további 3 órán át. A keletkezett kopolimert kiszűrjük és 110C°-on 20 órán át szárítjuk, majd elporítjuk és adott szemcseméretre szitáljuk. 25 2. példa Mindenben az 1. példa szerint járunk el, azzal a 30 különbséggel, hogy sztirol helyett 88,5 g orto-metil-sztirolt használunk. 3. példa 35 56,06 g itakonsavanhidrid, 78 g sztirol, 21,5 g metakrilsav, 0,74 g 63%-os divinilbenzol és 1,77 g benzoilperoxid keverékét 400 g toluolban 3 órán át 80 C -on kevertetjük, majd ezen a hőmérsékleten 40 tartjuk további 3 órán át. Lehűlés után a keletkezett kopolimert kiszűrjük és HOC -on 20 órán át szárítjuk, majd elporítjuk és szitáljuk. 4. példa 1 g tripszint (kétszer kristályosítva 9000 E/g Merck) feloldunk 20 ml 0,1 M 7,5 pH értékű foszfát pufferben, majd 1 g az 1. példa szerint 50 elkészített kopolimert adunk hozzá +4 C°-on. A pH-t 7,5 értéken tartva 6 Órán át kb. 14 ml 0,3 M ammóniumhidroxid oldatot adagolunk mindaddig, míg a pH további csökkenést nem mutat, azaz a hidrolízis teljessé nem válik. A gyanta ezen idő 55 alatt fokozatosan duzzad, majd felveszi a teljes folyadékmennyiséget. Ezután a kopolimert a meg nem kötött enzimtől kimossuk és a mosófolyadékból aktivitást mérünk, majd az oldhatatlan enzimet liofilizáljuk. 60 I. mosófolyadék: 20 ml 7,5 pH ért. 0,1 M foszfát pufferoldat, II. mosófolyadék: 2 x 20 ml 1,0 M nátriumklorid oldat, III. mosófolyadék: 2 x 20 ml desztillált víz. 65 Tripszin: 1 g x 9000 E/g = 9000 E I. mosófolyadék: 20 mix 87 E/ml = 1740 E II. mosófolyadék: 40 mix 12 E/ml = 480 E III. mosófolyadék: 40 mix 9 E/ml = 360 E I + II + III = 2580 E Az oldhatatlan enzim súlya: 1724 mg Az oldhatatlan enzim specifikus aktivitása: 3700 E/g 5. példa Mindenben a 4. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy 1 g (4400 E/g) penicillin acilázt kötünk meg. Penicillin aciláz: 1 g x 4400 E/g = 4400 E I. mosófolyadék: 20 ml x 40 E/ml = 800 E II. mosófolyadék: 40 mix l,3E/ml= 52 E III. mosófolyadék: 40 ml x 0,5 E/ml = 20 E I = II = III = 872 E Az oldhatatlan enzim súlya: 1812 mg Az oldhatatlan enzim specifikus aktivitása: 1815 E/g 6. példa Mindenben a 4. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy 1 g 2. példa szerinti kopolimert használunk. Az oldhatatlan enzim súlya: 1532 mg Az oldhatatlan enzim specifikus aktivitása: 3067 E/g 7. példa Mindenben a 4. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy 1 g 3. példa szerinti kopolimert használunk. Az oldhatatlan enzim súlya: 1478 mg Az oldhatatlan enzim specifikus aktivitása: 2874 E/g 8. példa Mindenben a 4. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy 1 g 1-arginint kötünk meg. A kopolimer-1-arginin komplex súlya: 1632 mg 9. példa Mindenben a 4. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy 1 g 1-lysint kötünk meg. A kopolimer-1 -lysin komplex súlya: 1592 mg 3
