169971. lajstromszámú szabadalom • Eljárás koleszterinoxidáz előállítására mikroorganizmusokból
MAGTAR NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS Bejelentés napja: 1973. V. 16. (BO-1437) Német Szövetségi Köztársaság-beli elsőbbsége: 1972. V. 17. (P 22 24 131.2 P 22 24 133.4) Közzététel napja: 1976. X. 28. Megjelent: 1977. XI. 30. 169971 Nemzetközi osztályozás: C12D 13/10, C 07 G 7/028 .•^•^•••••>L:£ Feltalálók: dr. Gruber Wolfgang vegyész, Garatshausen, dr. Bergmeyer Hans Ulrich vegyész, dr. Nelböck-Hochstetter Michael vegyész, dr. Beaucamp Klaus vegyész, dr. Holz Günter vegyész, Gramsall Johanna biológuslaboráns, Lang Günter laboráns, Tutzing, Német Szövetségi Köztársaság Tulajdonos: Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim-Waldhof, Német Szövetségi Köztársaság Eljárás koleszterinoxidáz, előállítására mikroorganizmusokból 1 A találmány tárgya eljárás egy új enzimnek, a koleszterinoxidáznak az előállítására. Közelebbről a találmány tárgya eljárás koleszterinoxidáz mikroorganizmusokból való előállítására alkalmas mikroorganizmusok tenyésztése, valamint bizonyos mikroorganizmusoknak kiindulási anyagként történő felhasználása révén. Ismeretes, hogy számos mikroorganizmus képes koleszterin átalakítására. így például Turfitt 188 baktérimtörzset ír le (J. Bacteriol. 47 487-493, 1944), amelyek szénforrásként kizárólag koleszterint tudnak felhasználni. Feltételezhető, hogy a koleszterin lebontása nagyszámú organizmus koordinált hatására következik be. Az is ismeretes, hogy glicerin-szénforráson nőtt Mycobacterium cholesterolicum a koleszterint kolesztenonná alakítja át. Ha ezt a mikroorganizmust koleszterinen hagyják növekedni, akkor kolesztenon helyett túlnyomórészt koleszténdion képződik (J. Biol. Chem. 206, 511-523, 1954). A reakciómechanizmus felderítése azon hiúsult meg, hogy nem található olyan oldható enzimrendszer, amely a koleszterin lebontását véghez tudná vinni. A koleszterinfogyasztásban résztvevő enzimekről ezért semmit sem tudunk. Mindazonáltal fontos lenne a koleszterint átalakító enzimet megismerni, mivel várható, hogy ilyen enzim érdekes egy specifikus koleszterinmeghatározási módszer számára. Ilyen specifikus koleszterin meghatározási módszer a mai napig nem ismeretes, bár az orvosi diagnosztikában nagy jelentősége lenne. A Biochem.J. 101, 819-830 (1966) cikke szarvasmarha-mellékvesekéregben található koleszterin-5 oxidázt ismertet, amely azonban a koleszterin oldalláncát oxidálva pregnenolonná alakítja át. A találmány szerinti koleszterinoxidáz a koleszterin 3/J-helyzetében oxidál, és kolesztenont képez. A Biochem.J. 42, 376 (1948) cikke ismerteti 10 ugyan koleszterinnek Nocardia erythrppolis-szal történő hasítását, azonban nem írják le sem a metabolizmus lépéseit és termékeit, sem bármilyen koleszterinoxidáz izolálását. Charney-Herzog: Microbiol. Transformation of 15 Steroids c. könyve (1967, Academic,Press, New York, 544, 545 old.) szerint a Proactinonyces erythropolis species egyes szteroid-szubsztrátok 30-OH csoportját oxidálni képes. A találmány alapját ezért az a feladat képezi, 20 hogy oldható koleszterinátalakító enzimet nyerjünk és azt olyan mértékben tisztítsuk meg, hogy rutinjellegű koleszterinmeghatározási eljárásra alkalmas legyen. Azt találtuk, hogy a koleszterint átalakító mik-25 roorganizmusokból olyan enzim izolálható, amely a koleszterin átalakítását a következő egyenlet szerint katalizálja: koleszterin (HH) + 02 -* koleszt-4-én-3-on + H2 0 2 Az átalakulás H2 0 2 képződés mellett sztöchiomet-30 rikusan megy végbe. 169971
