169957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glikogénn-foszforiláz és izoenzimei kimutatására, illetve az izoenzimek szétválasztására vérszérumban

169957 10 módszer infarktusgyanús esetek pontos diagnosztikai kiértékelésére alkalmas.) Ha viszont infarktuson átesett személyek vérszérumát vizsgáljuk például az 1. példában ismertetett módon, az infarktus bekövetkezése után 2-4 órával már 0,2-110 mU/ml glikogén-foszforiláz összaktivitás mérhető. Ha az infarktusos betegtől vett vérszérurnot a fentiekben ismertetett módon az izoenzimek egymástól való szétválasztására korongelektroforetikus kezelésnek vetjük alá, akkor az akrilamidgélen leggyorsabban vándorló sávként a glikogén-foszforiláz összmennyiségére vonatkoztatva 90-100% mennyiségben az izofoszforiláz I enzim, mig 20 eset közül 4 esetben közel 10%-os mennyiségben az izofoszforiláz I izoenzimnél lassabban, de az izofoszforiláz III izoenzimnél gyorsabban vándorló sávként az izofoszforiláz II enzim észlelhető. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás a glikogén-foszforiláz, valamint izofoszforiláz I, izofoszforiláz II és izofoszforiláz III néven ismert izoenzimjei kvantitatív vagy félkvantitatív kimutatására vérszérumban, illetve az izoenzimek szétválasztására, azzal jellemezve, hogy a) A glikogén-foszforiláz kvantitatív meghatározására a célszerűen önmagában ismert módon végzett membránszűréssel töményített, majd glicil•glicint, merkapto-etanolt és etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó oldattal 1 :1 arányban kevert, vagy pedig nátrium-fluoridot, nátríum-0-glicerofoszfátot és merkapto-etanolt tartalmazó oldattal ekvilibrált keményítőoszlopra felvitel, azonos összetételű oldattal végzett mosás és 6,8 pH-értéken és 30C°-on nátrium-0-glicerofoszfátot, merkapto-etanolt és etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó oldattal végzett eluálás útján előkezelt vérszérumot 5 : 3 arányban glikogéntartalmú oldattal összekeverünk, az így kapott elegyhez 2 rész, glükóz-1-foszfátot és adenozin-monofoszfátot tartalmazó oldatot adunk, o a kapott elegyet 60 C -on inkubáljuk, majd triklór-ecetsawal denaturáljuk és végül a vizes fázisban a foszfáttartalmat ismert módon a foszfomolibdát-komplex redukciója útján optikai úton megállapítjuk, hogy b) a glikogén-foszforiláz kvantitatív meghatározására az a) változatban ismertetett módon előkezelt vérszérumot foszfoglükomutáz és glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz enzimek jelenlétében 6,8 pH-értéken adenozin-monofoszfátot, glikogént, kálium-hidrogén-foszfátot, glükóz-1,6-difoszfátot, magnézium•acetátot és nikotinamM-adenin-dinukleotidfoszfátot tartalmazó oldatokkal elegyítjük és a vizes fázisban a glükóz-1-foszfát tartalmat ismert módon ibolyántúli spektroszkópia útján meghatározzuk, vagy c) az egyes izoenzimek szétválasztására és félkvantitatív meghatározására az a) változatban előkezelt vérszérumot 2 :1 arányban 1,2 mólos szacharózoldattal hígítjuk, a kapott elegyet 0,1% glikogént tartalmazó továbbá trisz-(hidroxi-metil)-amino-metánt, etiléndiamin-tetraecetsavat és bórsavat tartalmazó oldattal pufferolt, akrilamid alapú elválasztógélre felvisszük, azon önmagában ismert módon végzett korongelektroforézissel az izoenzimekre szétválasztjuk és végül glükóz-1-foszfátot, adenozin-monofoszfátot, nátrium-0-glicerofoszfátot, etiléndiamin-tetraecetsavat, merkapto-etanolt és nátrium-fluoridot tartalmazó vizes oldatban végzett inku-5 bálás után az elválasztógélt jód és kálium-jodid keverékével kezeljük, a jelentkező jód-jód-kálium-elszíneződést pedig optikai úton, célszerűen denzitométérrel mérjük, vagy d) az izofoszforiláz I kvantitatív meghatáro-10 zására az a) változatban ismertetett módon előkezelt vérszérumot 5 : 3 arányban glikogéntartalmú oldattal összekeverjük, az így kapott elegyhez 2 rész, glükóz-1-foszfátot, adenozin-monofoszfátot és glükóz-6-foszfátot tartalmazó oldatot adunk, a ka-15 pott elegyet 60 C -on inkubáljuk, majd triklór-ecetsavval denaturáljuk és végül a vizes fázisban a foszfáttartalmat ismert módon a foszfomolibdát-komplex redukciója útján optikai úton mégállapítjuk, a kapott eredményt pedig az a) változatnál 20 kapott eredményből levonjuk. (Elsőbbsége: 1974. február 6.) 2. Eljárás a glikogén-foszforiláz, valamint izofoszforiláz I, izofoszforiláz II és izofoszforiláz III 25 néven ismert izoenzimjei kvantitatív vagy félkvantitatív kimutatására vérszérumban, illetve az izoenzimek szétválasztására, azzal jellemezve, hogy a) a glikogén-foszforiláz kvantitatív meghatáro-30 zására a célszerűen önmagában ismert módon végzett membránszűréssel töményített, majd glicil-glicint, merkapto-etanolt és etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó oldattal 1 :1 arányban kevert, vagy pedig nátrium-fluoridot, nátrium-0-glicerofoszfátot 35 és merkapto-etanolt tartalmazó oldattal ekvilibrált keményítőoszlopra felvitel, azonos összetételű oldattal végzett mosás és 6,8 pH-értéken és 30 C -on natrium-ß-glicerofoszfatot, merkapto-etanolt és etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó oldattal végzett 40 eluálás útján előkezelt vérszérumot 5 :3 arányban glikogéntartalmú oldattal összekeverünk, az így kapott elegyhez 2 rész, glükóz-1-foszfátot és adenozin-monofoszfátot tartalmazó oldatot adunk, a kapott elegyet 60 C -on inkubáljuk, majd triklór-ecet-45 savval denaturáljuk és végül a vizes fázisban a foszfáttartalmat ismert módon a foszfomolibdát-komplex redukciója útján optikai úton megállapítjuk, vagy b) az egyes izoenzimek szétválasztására és fél-50 kvantitatív meghatározására az a) változatban előkezelt vérszérumot 2 :1 arányban 1,2 mólos szacharóz-oldattal hígítjuk, a kapott elegyet 0,1% glikogént tartalmazó, továbbá trisz-(hidroxi-metil)-amino-metánt, etiléndiamin-tetraecetsavat és bórsavat tar-55 talmazó oldattal pufferolt, akrilamid alapú elválasztógélre fel visszük, azon önmagában ismert módon végzett korongelektroforézissel az izoenzimekre szétválasztjuk és végül glükóz-1-foszfátot, adenozin-monofoszfátot, nátrium-0-glicerofoszfátot, etilén-60 diarnin-tetraecetsavat, merkapto-etanolt és nátrium-fluoridot tartalmazó vizes oldatban végzett inkubálás után az elválasztógélt jód és kálium-jodid keverékével kezeljük, a jelentkező jód-jód-kálium-elszíneződést pedig optikai úton, célszerűen den-65 zitométerrel mérjük, vagy 5