169831. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-amino-penicillánsav előállítására benzil-penicillinből vagy fenoxi-metil penicillinből vízben oldhatatlan enzim komplexxel

3 169831 4 kat, vagy más nitrogéntartalmú funkciós csoportokat tartalmazó anyagokat, továbbá karboximetilcellulózt vagy semleges kémhatású polimereket, melyek funkciós csoportjai észter csoportok. Megfigyelték, hogy a negatív töltésű funkciós csoportokat tartalmazó szubsztrátok előnyösebbek a pozitív töltésű funkciós csoportokat tartalmazó szubsztrátoknál. így például összehasonlítható kísérletet végeztek kétféle cellulózzal, melyek egyike pozitív, másika negatív töltésű funkciós csoportot tartalmazott. Az egyik kísérleti anyag a dietilaminoetil-cellulóz (DEAE), a másik a karboximetilcellulóz (CM) volt. A penicillin-aciláz szubsztráthoz való kötődéséhez optimális körülmények között, ugyanazzal az enzim-oldattal végezték a hordozóra való kapcsolást. A DEAE cellulózhoz rögzített enzimkészítmény aktivitása az eredeti enzimoldat aktivitásának 11%-a, a CM cellulózhoz rögzített készítményé az eredeti 42%-a volt. A kísérletet egy más enzim oldattal megismételve a DEAE cellulózra kötött készítmény az eredeti aktivitás 56%-át mutatta. Az említett, cellulózból készített enzim komplexek mechanikai stabilitása azonban igen gyenge volt, amint ezt Lilly és munkatársai közölték (Second Engineering Foundation Conference on Enzyme Engineering, Hennicker, 1973. augusztus). Az olyan enzim komplexek sem rendelkeznek kielégítő reakcióképességgel, amelyek az adszorpciós-térhálósításos technikával készültek, de ahol a szubsztrát semleges kémhatású polimer. Az ilyen komplexek további felhasználásra sem alkalmasak. így például a semleges kémhatású Amberlite XAD—7 szubsztrátra adszorbeált penicillin-acilázzal készített, térhálósított rögzített enzimkészítmény aktivitása 37 °C-on 14 napig tartó tárolás közben 66%-kal csökkent. Vizsgálataink során arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy az idézett 2 143 062 számú NSZK közrebocsátási iratban javasolt módszerrel készített rögzített enzimkészítmények igen nagy és többszöri felhasználás után is megmaradó aktivitást mutatnak a 6-APA előállításban akkor, ha polimerként akrilsav vagy metakrilsav polimert használunk, vagyis olyan alifás típusú polimeréket, amelyek karbonsav funkciós csoportot tartalmaznak. Az ilyen készítmények jó stabilitását a 37 °C-os tárolási kísérletek eredményei is bizonyítják, így az aciláznak Amberlite IRC—50 metakrilsav polimerre való adszorpciója és azt követő térhálósítás útján előállított készítmény 37 °C-on 14 napig tartó tárolás során mindössze 5%-ot vesztett aktivitásából. Az ilyen enzim komplexek ugyanakkor igen nagy mechanikai stabilitással rendelkeznek. Ez a sajátság igen fontos akkor, ha az enzimkészítményt az újabban széles körben terjedő tökéletesített reaktor-rendszerekben használjuk. Egy ilyen rendszerben az oldhatatlan enzim komplexet egy megfelelő méretű szitával visszatartják egy keverős reaktorban. A 6-APA előállítási reakció befejeződése után a reakcióelegyet eltávolítják, és a reaktorban visszamaradt enzimkészítmény ismét használható egy újabb reakcióban. E megoldás révén minimumra csökken az enzimnek az a fizikai vesztesége, amely annál a módszernél volt tapasztalható, amely szerint az egész reakcióelegyet eltávolították a reakciós edényből, és az oldhatatlan enzim készítményt kiszűrés vagy kicentrifugálás után juttatták vissza az edénybe. Az új technológia további előnye, hogy elkerülhető általa az enzimkészítmény bakteriális fertőzése. Mindehhez azonban az szükséges, hogy az enzim komplex ne töredezzék, mert akkor átjutna az enzimkészítmény visszatartására szolgáló szitán. Tekintettel arra, hogy Reagen, Dunhill és Lilly megállapítása szerint [Biotechnology, Bioengineering XVI, (1974), 333—343] azok a kis részecskék, amelyek az aminoetil-cellulózzal kötött béta-galaktozidáz enzimet tartalmazó készítményről leváltak, jóval nagyobb aktivitást mutattak, mint a nagyobb darabkák, valószínű, hogy az enzimkészítmény töredezése folytán levált darabkáknak a reaktorból való távozásával az enzimkészítmény aktivitása a súlyveszteség arányánál jóval nagyobb arányban csökkenne. Egy másik reaktorrendszerben, amelyet a 782 646 számú belga szabadalmi leírás ismertet, az enzimkészítményt olyan oszlopos reaktorban tartják vissza, melyen a szubsztrát nagy sebességgel halad át, és a szükséges pH beállítást egy az oldhatatlan enzimtől elkülönített edényben végzik. A szubsztrátnak természetesen nem szabad töredeznie a gyorsan áramló keverék hatására. Mindkét reaktorrendszer átalakítható folyamatos üzemű reaktorrendszerré, amikoris az'enzim aktivitásával és többszöri felhasználhatóságával kapcsolatos problémák ismét felmerülnek. Azt találtuk továbbá, hogy ha az enzim komplexet az akrilsav vagy metakrilsav polimerre való fent említett adszorpció és azt követő dialdehides térhálósítás útján készítjük, akkor a kapott vízoldhatatlán enzimkészítményt úgy használhatjuk 6—APA előállítására, hogy nem szükséges külön gondot fordítani a felszabaduló oldallánc semlegesítésére használt bázis megválasztására. Nevezetesen azt találtuk, hogy ellentétben az olyan rendszerekkel, ahol az enzim közvetlenül, kovalens kötéssel kapcsolódik a polimer szubsztráthoz, a találmány szerinti enzimkészítmények alkalmazása esetén a szokásos nátriumhidroxidot lehet használni semlegesítéshez, így elkerülhető a berendezésnek az illékony bázisok, így az ammónia vagy trietilamin használata esetén szükséges módosítása. Az enzimnek a szubsztrátra való adszorpciója és in situ térhálósítása mint az enzim közvetlen kovalens kötéssel való kapcsolásától eltérő eljárás az 1 257 263 számú nagybritanniai szabadalmi leírásban van ismertetve. E leírás azonban nem említi a penicillin-aciláz enzimeket, és nem említi azt sem, hogy akrilsav vagy metakrilsav polimert lehet szubsztrátként használni. Kiterjeszti viszont az enzim szubsztrát körül való íérhálósításának koncepcióját a vízoldható dialdehidektől eltérő polifunkciós reagensek, így a bisz-diazo-o-dianizidin használatára vonatkozó javaslattal. Ez a kiterjesztett koncepció a találmány szerinti eljárásban is alkalmazható. A találmány szerinti eljárásban olyan vízben oldhatatlan enzim komplexet használunk, mely penicillinaciláz enzimet tartalmaz egy vízben oldhatatlan polimer hordozóra adszorbeálva. A polimer hordozó egy vízben oldhatatlan metakrilsav polimer vagy kopolimer, melyre az enzim egy térhálósító szerrel, éspedig glutáraldehiddel, glioxállal vagy formaldehiddel van kapcsolva. A vízben oldhatatlan enzim komplexet úgy állítjuk elő, hogy a penicillin-aciláz enzimet egy vízben oldhatatlan metakrilsav polimerre vagy kopolimerre adszorbeáltatunk, azután a polimert egy térhálósító szerrel, éspedig glutáraldehiddel, glioxállal vagy formaldehiddel kezeljük. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2