169827. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-amino-cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására
169827 .n 9 10 1. e) példa (F) reakció vázlat) Kiindulási anyag: 696 mg 7-[(oc-fenil-a-amino)-acetämido]-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav. Végtermék: 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav. Hozam: 364 mg (85%); tisztaság: 98%. 2. példa (D) reakcióvázlat) 1 kg 7-fenilacetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat 12,5 liter vízben oldunk, és 38 °C-on 1 kg, az A) példa szerint előállított, hordozóhoz kötött penicillin-acilázt adunk hozzá. A pH értéket folyamatos trietilamin-adagolással állandóan 7,5 értéken tartjuk. 2 óra elteltével a reakció befejeződött. Az enzimgyantát kiszűrjük és 2 liter vízzel mossuk. A mosóvízzel egyesített szűrletet 30—40 °C-on vákuumban 3 liter térfogatra betöményítjük. A tömény oldathoz 2 liter butilacetátot adunk, és a pH értéket 5 n sósavval 3,7+0,1 értékre beállítva a 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat kicsapjuk. 2 óra múlva a kristályokat leszívatjuk és 1 liter vízzel, majd 1 liter acetonnal mossuk. A terméket 40 °C-on vákuumban szárítjuk. Hozam: 574 g (az elméleti hozam 89%-a); tisztaság: 98%. Azonos módon eljárva ugyanazt az enzimgyantaadagot 25-ször egymás után alkalmaztuk. Az elért hozamok átlaga 90,3% volt. 3. példa (D) reakcióvázlat) 2 g (6 m mól) 7-fenilacetamido-3-metil-cef-3-em-4--karbonsavat 190 ml vízben szuszpendálunk, majd pH 7,8-ig 1 n káliumhidroxid-oldatot adagolva oldatba visszük. Az oldatot 37 °C-ra melegítjük és 3,2 g, az A) példa szerint előállított enzimgyantát adunk hozzá. A reakció alatt a pH-ttrietilamin hozzáadásával 7,8+ 0,3 értéken tartjuk. 1,5 óra múlva a reakció befejeződött. Az enzimgyantát leszűrjük, vízzel mossuk, és a mosóvizet a szűrlettel egyesítjük. A szűrletet 50 °C-on vákuumban eredeti térfogatának egy negyedére betöményítjük, a tömény oldathoz 160 ml metilizobutilketont adunk, és a pH-értéket híg sósavval, 4,3-ra állítjuk be. Az elegyet 1 órán át állni hagyjuk, majd a kikristályosodott 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat leszívatjuk. A terméket kevés víz-metilizobutilketon-eleggyel mossuk. Hozam: 1,01 g (78,8%). Olvadáspont: 238—240 °C (bomlás közben). 4. példa 500 g 7-fenilacetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat 8,3 liter vízben oldunk, majd 38 °C-on 220 g, a C) példa szerint előállított enzimgyantát adunk hozzá. A szubsztrátum 4 óra alatt teljesen reagál (D) reakcióvázlat). A képződött 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat kicsapjuk és szárítjuk. Hozam: 294 g (az elméleti hozam 91%-a); tisztaság: 97%. Azonos módon ugyanazzal a gyanta-adaggal 25-ször folytatjuk le a fenti reakciót. A 25 reakció átlaghozama 90,5%. 5. példa (E) reakcióvázlat) 500 g 7-fenoxiacetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat 8,3 liter vízben 38 °C-on 1,1 kg, a C) példa szerinti 5 enzimgyantával reagáltatunk. A reakciót befejezettnek tekintjük, ha a pH állandó értéken tartásához további trietilamin-adagolás már nem szükséges. Az elegyet a 2. példa szerint dolgozzuk fel. Hozam: 265 g (86%) 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-kar-10 bonsav. Tisztaság: 98%. A) példa 15 A találmány szerinti eljárásban alkalmazható enzimgyanta előállítása 80 g tetraetilénglikol-dimetakrilátot, 20 g maleinsavanhidridet és 1 g azoizovajsavnitrilt 1 liter benzolban fel-20 oldunk. Az oldatot 4 órán keresztül 60 °C-on tartjuk. Utána 1 g azoizovajsavnitrilt, valamint 200 ml 100—140 °C forráspontú petrolétert adunk hozzá, és további 5 órán keresztül polimerizáljuk. A porszerű terméket leszívatjuk, egyszer benzolban, majd háromszor 30—50 25 °C forráspontú petroléterben szuszpendálva mossuk, utána vákuumban szárítjuk. Hozam: 94 g. Fajlagos térfogat ömlesztett állapotban: 3,5 ml/g. Duzzasztott térfogat: 4,7 ml/g (vízben). 30 Fajlagos felület: 5 m2 /g. Az anhidridcsoportok elszappanosítása utáni savtartalom : 3,5 milliegyenérték/g. A fentiek szerint előállított hordozógyantából 100 g-ot 48 000 egység penicillin-aciláz 3,5 liter vízzel készített 35 oldatában szuszpendálunk (a penicillin-aciláz fajlagos aktivitása a biuret-teszt szerint: 12 egység/mg protein). A pH-t 1 n nátriumhidroxid-oldat hozzáadásával az egész reakcióidő alatt (20 órás keverés 25 °C-on) 6,3 értéken tartjuk. Utána a gyantát nagy üvegszűrőn át 40 szűrjük és 5 liter 0,05 m, 1 m nátriumkloridot tartalmazó, 7,5 pH-jú foszfátpufferrel, majd 5 liter azonos, de nátriumkloridot nem tartalmazó pufferrel mossuk. 500 g (nedves állapotban mért súly) 58 E/g aktivitású enzimgyantát kapunk, ami 29 000 egység hordozóhoz 45 kötött penicillin-aciláznak, azaz mintegy 60%-os hozamnak felel meg. B) példa 50 Az enzimgyanta készítéséhez szükséges penicillin-aciláz előállítása a) Az Escherichia coli mikroorganizmust az 1 111 778 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi le-55 írásban ismertetett módon tenyésztve penicillin-acilázt tartalmazó nyers extraktumot nyerünk. A tenyészetet centrifugálással iszappá betöményítjük, és a sejteket ismert mechanikai eljárások szerint — adott esetben 3% metilizobutilketon hozzáadásával — feltárjuk. 60 b) Összesen 5,2-106 egységet tartalmazó 610 liter nyers extraktumot ionmentes vízzel 2100 literre hígítunk, kénsavval a pH-t 5,0-ra beállítjuk, majd centrifugáljuk. A felülúszó részben 5,1 • 106 egység van, a fajlagos aktivitás 1,7 E/mg. A pH-t állandóan 5 értéken 65 tartva 13,8 kg bentonitot (B II típus, gyártja: Erbslöh 5
