169827. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-amino-cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására
3 169827 4 hidrofil monomerből összetett kopolimerizálható egységekből álló térhálósított kopolimerizátum — és a kapott (I) általános képletű 7-amino-cef-3-em-4--karbonsav-származékot elkülönítjük. Meglepő módon a kovalens kötéssel hordozóhoz kapcsolt penicillin-aciláz a (II) általános képletű cefalosporin származékokat gyakorlatilag ugyanolyan gyorsan bontja, mint a megfelelő penicillineket. Az ismert eljárásokkal szemben a találmány szerinti eljárásnak számos előnye van. Míg például sejttenyészetekből származó enzimeket csak egyszer lehet használni, a hordozóhoz kapcsolt penicillin-acilázt ismételten alkalmazhatjuk. A találmány szerinti eljárás továbbá az (I) általános képletű vegyületeket igen nagy tisztaságban és jó hozammal eredményezi, ugyanakkor a szükséges műszaki beruházás csekély. A 2 212 276 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságrahozatali iratban ismertetett, csupán adszorpcióval kötött enzim alkalmazásán alapuló eljárással szemben a kovalens kötéssel kötött penicillin-aciláz használatának az az előnye, hogy még a (II) általános képletű cef-3-em-4-karbonsav-származékok magas koncentrációja esetén is az enzim teljes mértékben kötve marad, ami a találmány szerinti eljárás gazdaságosságát lényegesen fokozza. Ha kiindulási anyagként például 7-fenilacetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat alkalmazunk, a reakciót az A) reakcióvázlattal szemléltethetjük. A kiindulási anyagként alkalmazható vegyületeket a (II) általános képlet egyértelműen definiálja. Az R1 alkilcsoport egyenes vagy elágazó szénláncú 1—4 szénatomos, előnyösen 1—2 szénatomos alkilcsoportot, például metil-, etil-, n- és izopropilcsoportot jelent. A Het jelzésű, 5—6 tagú heteroaromás gyűrű heteroatomként nitrogénatomot tartalmaz. Het előnyös jelentése piridinium-csoport. A (II) általános képletű vegyületeknek a találmány szerinti eljárásban alkalmazható sóiként az alkálifém-, így nátrium- vagy kálium-, az alkáliföldfém-, például kalcium-, továbbá az ammóniumsókat és az alifás, aralifás vagy aromás aminokkal alkotott sókat említjük meg. Aminként az alkilcsoportonként 1—4 szénatomot tartalmazó, az alkilcsoportokban adott esetben hidroxilcsoporttal szubsztituált primer, szekunder és tercier aminokat, így etil-, trietil- és hidroxietilamint, ciklusos aminokat, például a piridint, piperidint, morfolint, piperazint és N-metil-piperazint nevezzük meg. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható (II) általános képletű vegyületek ismertek, illetve ismert eljárások szerint állíthatók elő (lásd: Flynn B.E.H.: Cephalosporins and Penicillins, Chemistry and Biology, Academic Press, New York, 1972). A találmány szerinti eljárásban különösen előnyösen alkalmazható (II) általános képletű vegyületekként az alábbiakat soroljuk fel: R R2 R3 x a) —OCOCHg tien-2-il—H —H b) (III) képi. cs. tien-2-il—H — c) —H fenil-NH2 —H d) —H fenil—H —H e) —H fenoxi—H —H f) —O—CO—CH3 fenoxi—H —H g) —O—CO—CH3 fenil—H —H h) —O—CO—CH3 fenil—NH2 —H Különösen előnyösnek a d)—g) jelzésű képletű vegyületek bizonyultak. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható hordozóhoz kapcsolt penicillin-aciláz a legkülönbözőbb 5 eredetű lehet. A penicillin-aciláz (Enzyme Comission 3.5.1.11) számos mikroorganizmusból általánosan ismert eljárások szerint állítható elő (lásd például: 1 907 365 és 2 217 745 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra-10 hozatali irat). Alkalmas termelő törzsek például az alábbiak: Escherichia coli, Erwinia vagy Actinomycetes, így Streptomyces, Micromonospora, Norcardia, vagy egyes gombák, például Fusarium vagy élszető törzsek. Különösen előnyös az ATCC 11 105 sz. alatt letétbe 15 helyezett Escherichia coli törzsből nyert penicillin-aciláz alkalmazása. Az Escherichia coli törzsből például a 2 217 745 sz. német szövetségi köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali iratban ismertetett eljárás sze' rint izolálhatjuk a penicillin-acilázt: az Escherichia coli 20 tenyészetéből nyert, a penicillin-aciláz mellett még sejtmaradékokat tartalmazó nyers extraktum pH értékét 3,5—5,5 előnyösen 5,0 értékre beállítjuk, az extraktumot centrifugáljuk, majd a felülúszó tiszta oldatot valamely alumínium-szilikáttal, előnyösen bentonittal ke-25 zeljük. Utána az adszorbeáló anyagot kiszűrjük és például 0,1—1,0 m nátrium- vagy káliumacetát-oldattal mintegy pH 8,5 mellett eluáljuk. A kapott, dúsított és tiszta penicillin-aciláz-oldatot kívánt esetben makropórusos ioncserélők, például szulfoetil-cellulóz segítsé-30 gével végzett kromatográfia útján tovább tisztíthatjuk. A találmány szerinti eljárásban gyakorlatilag minden olyan enzimgyantát alkalmazhatunk, amelyben a penicillin-aciláz kovalens kötéssel kapcsolódik a vízben nem oldható hordozó polimerizátumhoz. Az enzimet 35 kovalens kötésben tartalmazó enzimgyanták ismertek, illetve ismert eljárások szerint állíthatók elő (lásd például: 1 907 365 és 2 217 745, továbbá az 1 917 057, 2 157 972, 2 215 539, 2 215 687 és 2 008 996 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságrahozatali irat; 40 Katchalski E.: Biochemistry 3, 1905—1919. old. (1964); Orth H. D. és Brümmer W.: Angewandte Chemie 84, 319—368. old. (1972)]. Alkalmazhatunk például olyan enzimgyantát, amelyben a penicillin-acilázt brómcián segítségével kovalensen valamilyen poliszacharidhoz, 45 például dextránhoz vagy térhálósított agarózhoz kötötték. Alkalmazhatunk továbbá penicillin-aciláz és brómacetil-cellulóz reakciója során kapott enzimgyantát vagy penicillin-aciláz és karboxilcsoportokkal helyettesített térhálósított dextrán alapú ioncserélő gyantának amid-50 képző vegyületek, például karbodiimid jelenlétében végzett reagáltatása útján előállított enzimgyantát. Az utóbbi előállítási eljárásban a dextrán alapú ioncserélő helyett aktivált ioncserélőgyanták, így akrilsavgyanták savkloridja, valamint etilénből és maleinsavanhidridből 55 hidrazinnal végzett térhálósltás útján előállított gyanták is alkalmazhatók (lásd: 1 917 057 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságrahozatali irat). Előnyös azonban a 2 157 972 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságrahozatali iratban ismertetett enzim-60 gyanta alkalmazása. Az akrilamidból, N,N'-metilén-bisz-akrilamidból és maleinsavból álló keverékpolimerizátumhoz kovalens kötéssel kapcsolt penicillin-acilázt az alábbiak szerint állítják elő: A keverékpolimerizátumot önmagában ismert módon 65 készítik. Polimerizálás után a gélszerű gyantát 0,5 mm 2
