169795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa- vagy béta-típusí kristályos 7-(D-alfa-amino-fenil-acetamido) -3-metil-cef-3-ém -4-karbonsav-monohidrát előállítására
7 169795 8 (Az 1. táblázat folytatása) a-típusú |3-típusú Térköz, d Relatív intenzitás I/Ij Térköz d Relatív intenzitás I/Ij 1,77 0,02 1,93 1,87 1,85 1,82 1,72 1,66 1,62 0,05 0,05 0,05 0,10 0,05 0,02 0,02 1. példa Három napos Acetobacter turbidans IFO 3225 ferdeagar-tenyészetről kacs segítségével 100 ml, az alábbiakban megadott összetételű táptalajt oltunk (pH 7,0): Polipepton (Daigo Nutritive Chemicals Ltd, Osaka) 1,0% Húskivonat 1,0% Nátriumklorid 0,5% A tenyésztést rázóasztalon, 28 C° hőmérsékleten 8 órán át végezzük. A tenyészettel 5 liter, pH 7,0-es, a következő összetételű táptalajt oltunk: Dextrin 3,0% Kukoricalekvár 2,5 KH2 P0 4 0,2% MgS04 0,05% FeS04 0,001% MnS04 0,001% Nátriumklorid 0,2% Habzásgátló kevés A beoltott tenyészetet 24 órán át, 28 C° hőmérsékleten rázóasztalon inkubáljuk. Ezután centrifugálással összegyűjtjük a sejteket és 1 liter vízben szuszpendáljuk őket. A szuszpenzióhoz 4 liter, 50 g 7-amino-3-metil-cef-3-ém-4-karbonsavat és 125 g D-fenilglicin-metilészter-hidrogénkloridot [Előállítását lásd Ber. 41, 2071 (1908)] tartalmazó 2 n nátriumhidroxiddal 6,0-ra beállított pH-jú vizes oldatot adunk, és 2 órán át, 30 C° hőmérsékleten, pH 6,0-on keverjük a reakcióelegyet, mialatt a reakció lezajlik. A biológiai értékmérés szerint a reakcióelegyben 65 g cefalexin halmozódott fel. 2 n hidrogénklorid oldattal 4,5-re állítjuk be a reakcióelegy pH-ját, majd a sejtek eltávolítására azonnal centrifugáljuk. A felülúszót sorbakötött, két kromatografáló oszlopon vezetjük át, az egyik oszlop 850 ml szulfonsav-típusú, erősen savas kationcserélő gyantával (Amberlite IR—120B; Na-ciklus, Rohm és Haas Co., USA), a másik 2,8 liter kromatográfiás minőségű aktív szénnel (Takeda Chemical Industries Ltd., Japán) van megtöltve. Az oszlopokat ezután sorban 14 liter tiszta vízzel öblítjük, az aktív szénnel töltött oszlopot pedig 14 liter 7%-os vizes n-butanollal eluáljuk. Az oszlopon óránként az oszloptérfogatnak (V) megfelelő S térfogatú elegyet engedünk át (S/V = 1,0). Az analízis szerint az eluátum a 61 g cefalexinen kívül kevés D-fenilglicint; 7-amino-3-dezacetoxi-cefalosporánsavat, fehérjéket, színanyagot stb. tartalmaz. 14 liter ilyen szennyezett, cefalexint tartalmazó oldat pH-ját 2 n hidrogénkloriddal 1,8-ra állítjuk be, majd forró filmbepárlóval, csökkentett nyomáson, 20 C° belső hőmérsékleten 300 ml-re töményítjük. Ezután 35 C° állandó hőmérsékleten, keverés közben, 1 n nátriumhidroxid oldattal 4,5-re állítjuk be a sűrítmény pH-ját (ez a cefalexin izoelektromos pontja), amikor fehér színű, hasáb alakú kristályokból álló szuszpenziót kapunk. Centrifugálással elkülönítjük a kristályokat és vízzel mossuk őket. Az eljárás végén olyan cefalexin-dihidrát, hasáb alakú kristályokból álló terméket kapunk, amely a Kari Fischer titrálás szerint 9,6% (2 mól) vizet tartalmaz. Két egyenlő részre osztjuk a hasáb alakú kristályokból álló dihidrát terméket; az egyik részt 20 C° hőmérsékleten, 10 órán át csökkentett nyomású térben szárítjuk, amikor 26 g kristályos cefalexint kapunk. A termék sűrű, csak gyengén nedvszívó és állandó. A kristályok víztartalma a Kari Fischer módszer szerint 4,8% (1 mól); Röntgen-diffrakciós képük megegyezik az 1. táblázatban megadott (3-típusú cefalexin-monohidrát képével; [a]D = + 152° (konc: 0,5, vízben); Ämax=263 nm, Eí% =234 Op.: 194 C°. Az előállított vegyület a mágneses magrezonancia spektrum adatai szerint tiszta kristályokból áll. A dihidrát kristályokból álló termék másik felét foszforsavanhidrid felett, hűtés közben, 5 C° hőmérsékleten 16 órán át szárítjuk. Ily módon 25,5 g monohidrát kristályokat kapunk. A kristályok víztartalma Karl Fischer módszere szerint 4,5%, Röntgen-diffrakciós képük teljes mértékben megegyezik az 1. táblázatban megadott, a-típusú kristályok jellemző adataival. Az utóbbi, a-típusú kristályok összes többi fizikai és kémiai tulajdonsága teljes mértékben megegyezik a csökkentett nyomású térben szárított kristályok tulajdonságaival. A sűrűségi és nedvességi abszorpciós és deszorpciós vizsgálati eredmények adatai között nincs szignifikáns eltérés. 2. példa 65 g, az 1. példában megadott reakciókörülmények között előállított cefalexint tartalmazó reakcióelegy pH-ját 2 n hidrogénklorid oldattal 4,5-re állítjuk be, majd a mikroorganizmus sejtjeinek eltávolítása diatómaföldből készült szűrőágyon át csökkentett nyomáson szűrjük a szuszpenziót. A szűrletet két sorbakötött kromatografáló oszlopon vezetjük át, amelyek közül az elsőt 1 liter szulfonsav-típusú erősen savas kationcserélő gyantával (Amberlite IR—120B; Na-ciklus, Rohm és Haas Co.), a másikat 17 liter nem-ionos szintetikus adszorbenssel (XAD—II; Rohm és Haas Co.) töltjük meg. Ezután 17 liter tiszta vízzel öblítjük a gyantákat. A vizes mosófolyadék kevés D-fenilglicint és 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsavat tartalmaz. Elválasztjuk egymástól az oszlopokat, és a nem ionos 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
