169794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikrobiális lipáz előállítására
7 169794 8 A szubsztrátumot 2% polivinil-alkohol és gyógyszerkönyvi minőségű olívaolaj 3: 1 térfogatarányban történő elegyítése és az elegy keverőkészülékben, 4 °C hőmérsékleten 10 percig történő homogenizálása útján állítjuk elő. Ezután egy L-típusú kémcsőbe 5 ml fenti módon elkészített szubsztrátumot és 4 ml 0,1 mólos, 7,0 pH-értékű foszfát-pufferoldatot töltünk, majd ehhez az elegyhez a vizsgálandó lipáz-oldat 1 ml-nyi mennyiségét adjuk. A reakciót Monod-típusú rázókészülékben 50 percig folytatjuk 37 °C hőmérsékleten. Ezután a reakciót aceton és etanol 1: 1 térfogatarányú elegyének 20 ml mennyiségben való hozzáadása útján megszakítjuk, majd közvetlenül ezután a reakcióelegyet 0,05 n vizes nátrium-hidroxid-oldattal titráljuk, 1% fenolftalein indikátor jelenlétében. Egy lipáz-egység (1 E) annak az enzim-mennyiségnek felel meg, amely percenként 1 mikromól oleinsavval egyenértékű zsírsavat szabadít fel; a lipáz fajlagos aktivitását a milligrammonként! egységszámban (E/mg) fejezzük ki. Példa Egy 200 térfogatrész folyadék befogadására alkalmas fermentáló tartályba beadagolunk 40 tf. rész folyékony közeget, amelynek pH-értéke 6,0 és amely 2,0% búzakorpát, 0,5% rizskorpát, 8,0% kukoricalekvárt, 0,5% kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,2% kalcium-klorid-dihidrátot (CaCl2 . 2H 2 0) és 0,1% glicerin-propilénoxid-polimert (a Takeda Chemical Industries, Ltd. japán cég „Actcol" kereskedelmi elnevezésű készítménye) tartalmaz. Sterilizálás után a tartályban levő folyadékot beoltjuk az alább felsorolt mikroorganizmus-törzsek valamelyikének tenyészetével és 24 °C hőmérsékleten inkubáltatjuk, percenként 240 fordulattal történő keverés közben; a közeget ezalatt percenként és tf.részenként 1,0 tf.-rész levegővel szellőztetjük. A fermentáció meghatározott időtartamig való folytatása után a fermentlé szupernatáns folyadékában meghatározzuk a lipáz-aktivitást. A kapott eredményeket az alábbi táblázatban foglaltuk össze. Az eredmények azt mutatják, hogy valamennyi alább felsorolt mikroorganizmus nagy mennyiségben termelt oly lipáz enzimet, amely 7 körüli pH-értéken nagy aktivitást mutat. Törzs Lipáz-termelés (E/ml, pH = 7) Mikroorganizmus Törzs 48 óra 72 óra alatt Phycomyces nitens IFO 5694 35,9 17,4 Phycomyces nitens IFO 5695 31,1 14,6 Phycomyces nitens NRRL 2444 85,4 96,6 Phycomyces nitens NRRL 2678 37,0 11,4 Phycomyces blakesleeanus IFO 5822 84,9 81,5 Phycomyces blakesleeanus IFO 5823 38,0 36,4 Phycomyces blakesleeanus IFO 5870 30,1 37,5 Phycomyces blakesleeanus IFO 5871 82,3 74,0 Valamennyi törzset 72 óra hosszat inkubáltuk egy további kísérletben a fent leírthoz hasonló módon, majd a fermentlé szupernatáns folyadékához ammóniumszulfátot adunk 50% koncentrációban. A képződött 5 csapadékot vízzel szemben 4 °C hőmérsékleten történő dialízis útján mentesítjük a sótól, majd a dialízis termékeként kapott belső oldat lipáz-aktivitás szempontjából optimális pH-értékét és hőmérsékletét kísérletileg meghatározzuk. Ugyancsak megvizsgáljuk minden eset-10 ben az így kapott oldat lipáz-aktivitásának kutya-epe hozzáadása esetén mutatkozó megnövekedését. Azt tapasztaljuk e kísérletek eredményeképpen, hogy különböző törzsek által termelt lipáz azonos minőségű. Mikroorganizmus Törzs Optimális pH-érték Optimális hőmérséklet, °C Aktivitás növekedés epével Phycomyces nitens Phycomyces nitens Phycomyces nitens Phycomyces nitens Phycomyces blakesleeanus Phycomyces blakesleeanus Phycomyces baleksleeanus Phycomyces blakesleeanus IFO 5694 IFO 5695 NRRL 2444 NRRL 2678 IFO 5822 IFO 5823 IFO 5870 IFO 5871 6—7 6—7 6—7 6—7 6—7 6—7 6—7 6—7 37—40 37—40 37—40 37—40 37—40 37—40 37—40 37—40 igen igen igen igen igen igen igen igen Egy további kísérletben 20 000 tf.rész 6,0 pH értékű közeget, amely 2% dextrint, 2- kukoricalekvárt, 0,5% 45 kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,05% MgSOa . 7H a O-t és 0,1% glicerin-propilénoxid-polimert (a fent ismertetett „Actcol" készítmény) tartalmaz, beoltunk 500 tf.rész ugyanilyen összetételű közeggel, amelyben előzőleg Phycomyces nitens NRRL 2444 törzset szuszpendál-50 tunk. Egy 50 000 tf.rész befogadóképességű tartályban a fenti módon beoltott közeget 24 óra hosszat inkubáljuk 28 °C hőmérsékleten. Ezután az így előállított inokulum-kultúrából 6000 tf.rész mennyiséget hozzáadunk 55 100 000 tf.rész 6,0 pH értékű közeghez, amely 1% búzakorpát, 1% rizskorpát, 5% polipeptont, 0,5% kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,2% CaCl2 . 2H a O-t és 0,1% glicerin-propilénoxid-polimert („Actcol") tartalmaz. Ezt a műveletet egy 200 000 tf.rész befogadóké-60 pességű fermentáló tartályban végezzük és a leírt módon beoltott közeget 24 °C hőmérsékleten inkubáljuk, 66 óra hosszat, 200 fordulat/perc keverés és 2 l/perc/1 szellőzés mellett. Az inkubálás során az alább megadott időközökben meghatározzuk a fermentlé pH-értékét és az 65 addig termelt lipáz mennyiségét: 4
