169794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikrobiális lipáz előállítására

3 169794 4 a Northern Utilization Agriculture (NRRL) intézetekből is, ahol ezeket korábban deponálták. Felhasználhatók a találmány szerinti eljárásban az ilyen mikroorganizmus-törzsek spontán vagy mutagen kezelés útján mesterségesen előállított mutánsai is, amennyiben ezek lipáz-termelő képességüket megtartották. A találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazható mikroorganizmusok jellemző példáiként a következőket említhetjük: Phycomyces nitens IFO—5694, Phycomyces nitens IFO—5695, Phycomyces nitens NRRL—2444, Phycomyces nitens NRRL—2678, Phycomyces blakesleeanus IFO—5822, Phycomyces blakesleeanus IFO—5823, Phycomyces blakesleeanus IFO—5870, Phycomyces blakesleeanus IFO—5871. A fenti törzsek fent megadott nyilvántartási számai az IFO jelzésű számok esetében az Institute for Fermentation, Osaka (Japán), az NRRL számok esetében pedig a Northern Utilization Research and Development Division, U. S. Department of Agriculture intézetnél történt deponálás nyilvántartási számai; ezek a törzsek az említett intézetektől be is szerezhetők. Az említett mikroorganizmusok tenyésztése szilárd vagy folyékony tápközegen történhet; ipari termelés esetében előnyösen folyékony tápközeget alkalmazunk. Folyékony tápközeg alkalmazása esetén a tenyésztés aerob körülmények között történhet, rázott vagy kevert kultúrákban. A találmány szerinti eljárásban alkalmazandó tápközegeknek asszimilálható szénforrást, emészthető nitrogénforrást és szervetlen sókat kell tartalmaznia, adott esetben a növekedést elősegítő faktorok és esetleg más ismert adalékok kíséretében. Szénforrásként bármely ilyen célra szokásos asszimilálható széntartalmú anyag, például glükóz, szacharóz, mannit, dextrin, cellulóz, keményítő, oldható keményítő, glicerin, szorbit, búzakorpa, rizskorpa, melasz és hasonlók alkalmazhatók. Nitrogénforrásként is a szokásos ilyenfajta anyagok alkalmazhatók; ezek példáiként természetes anyagok és ezek származékai, például pepton, húskivonat, kazein, kukoricalekvár, zsírtalanított szójaliszt, közönséges szójaliszt, szója-préspogácsa, szárított élesztő, élesztőkivonat, gyapotmagliszt, siker vagy ilyen célokra előállított mesterséges készítmények, továbbá szerves savak ammóniumsói, mint ammónium-szukcinát, ammónium-tartarát, ammónium-acetát, valamint szervetlen nitrogénvegyületek, mint ammónium-klorid, ammónium-szulfát, ammónium-foszfát vagy nátrium-nitrát említhetők. A tápközegekben alkalmazandó szervetlen sók például különféle foszfátok, szulfátok és hidrokloridok lehetnek. A növekedési faktorok sorában például vitaminok, nukleinsavak vagy hasonló vegyületek kerülhetnek felhasználásra. Emellett, a fermentáció módjától és körülményeitől függően elősegíthető a kívánt enzim felgyülemlése azáltal is, ha természetes vagy szintetikus habzásgátlószereket, például szójaolajat, szilikonolajat vagy hasonlókat adunk a tápközeghez. A termelő fermentáció lefolytatása céljából előnyös oly módon eljárni, hogy először egy kisméretű előkultúrát készítünk, majd ezzel az előkultúrával oltjuk be a nagyméretű fermentáció céljaira szolgáló tápközeget. A fermentáció hőmérséklete, időtartama, a közeg pH-értéke, a levegőztetés és a keverés mértéke, valamint 5 az egyéb fermentációs körülmények bizonyos mértékig változhatnak az alkalmazott törzs fajtájától, a tápközeg összetételétől és hasonló tényezőktől függően; a szakember számára nem jelent nehézséget oly fermentációs körülmények megválasztása, amelyek az adott esetek-10 ben a kívánt lipáz enzim maximális mértékű felgyülemlését biztosítják a fermentációs közegben. így például a fermentáció hőmérséklete 15 °C és 45 °C, előnyösen 20 °C és 40 °C között, időtartama 10 óra és 240 óra, előnyösen 15 óra és 168 óra között le-15 het; a közeg pH-értéke 4—10, előnyösen 5,5—8, még előnyösebben 6—8 lehet; 0,5—5 liter/perc/liter tápközeg, előnyösen 0,5—3 liter/perc-liter tápközeg levegőztetéssel és percenként 50—400 fordulatszámú keveréssel dolgozhatunk. 20 Ha a fermentációt a fent leírt módon folytatjuk le, akkor a lipáz-termelő mikroorganizmus-törzs által termelt lipáz felgyülemlik a fermentációs közegben. Folyékony tápközeg alkalmazása esetén a kívánt lipáz legnagyobbrészt a fermentációs termék folyékony fázisá-25 ban gyülemlik fel. Ilyen esetekben célszerű a szilárd fázist képező sejttömeget szűrőprés vagy centrifuga segítségével eltávolítani és a kapott szűrletből illetőleg szupernatáns folyadékból kinyerni a termelt lipáz enzimet. 30 A fermentlé szűrleteként kapott lipáz-oldatot vagy ennek kivonatát csökkentett nyomáson történő bepárlás útján töményíthetjük be. A lipáz kinyerése során alkalmazhatunk a szakmában ismert elkülönítési és tisztítási módszereket is; ezáltal 35 az enzimet a kívánt tisztasági fokban különíthetjük el. így történhet a kívánt termék elkülönítése például oly módon, hogy az említett lipáz-tartalmú oldatot frakcionált lecsapásnak vetjük alá, valamely szervetlen só, mint ammónium-szulfát, nátrium-szulfát vagy nátrium-40 klorid hozzáadása útján, vagy pedig valamely erre alkalmas, vízzel elegyedő szerves oldószert, mint valamely alkoholt, például metanolt, etanolt vagy izopropanolt, vagy pedig acetont adunk az említett oldathoz. Az így kapott csapadékokat azután ugyancsak önmagukban 45 ismert módszerekkel tisztíthatjuk tovább. Alkalmazhatunk továbbá olyan tisztítási módszereket is, mint a kalcium-foszfát gélen, alumínium-oxidon, bentoniton, ioncserélő gyantán vagy más alkalmas adszorbensen történő adszorpció és deszorpció, dietilamino-etilcellu-50 lózon, karboximetil-cellulózon vagy más cellulózszármazékon történő kromatografálás, molekula-szűrők (például valamely dextrán-gél, mint Sephadex, a Pharmacia Fine Chemicals Co. Ltd. terméke, vagy Biogel, a Bio-Pad Laboratories cég terméke) alkalmazása stb.; 55 lecsapás valamely fehérje-lecsapószer, mint nukleinsav, tannin, foszfor-volframát vagy hasonlók segítségével; izoelektromos lecsapás; dialízis, elektrodialízis vagy elektroforézis; a szennyezéseknek valamely nehézfémsó, például ólom-acetát, továbbá bárium-acetát vagy kal-60 cium-acetát, cink-acetát, továbbá bárium-acetát vagy kalcium-acetát segítségével történő eltávolítása és hasonlók. Ilyen módon tetszőleges tisztaságban, oldat, por vagy kristályos termék alakjában állíthatjuk elő a kívánt lipáz enzimet. 65 A találmány szerinti eljárással előállított lipázt első-2