169764. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 30504 RP antibiotikum és származékai előállítására

11 169764 12 nat, élesztőkivonat, szeszmoslék, kukoricalekvár szintén használhatók. A táptalajhoz hozzáadott ásványi sók közül egyesek pufferoló vagy közömbösítő hatást gyakorolhatnak, ilyenek az alkálifémfoszfátok, az alkáliföldfémfoszfátok vagy a kalciumkarbonát és magnéziumkarbonát. Mások a Streptomyces gallinarius DS 25 881 anyagcseréjét aktiválják, ilyenek a cink, kobalt, vas, réz és mangán sói. A növekedést elősegítő anyagok közé tartoznak a természetes vitaminjellegű vegyületek, például a riboflavin, a fólsav és a pantoténsav. A fermentáló közeg pH-ja a tenyésztés kezdetén 5,8—7,8, előnyösen 6,2—7,4 lehet, és a fermentálás legkedvezőbb hőmérséklete 25—30 C°, de kielégítő termelés érhető el 23 C° és 33 C° közötti hőmérsékleteken is. A fermentálás folyamán a levegőztetés mértéke meglehetősen tág határok között változhat, de azt találtuk, hogy táptalaj-literenként és percenként 0,3—3,0 liter levegő átáramoltatása különösen jó eredményeket ad. A legnagyobb 30 504 RP antibiotikum hozamot 2—8 napi tenyésztés után érjük el; ez az idő lényegileg a használt táptalajtól függ. A közöltek alapján világos, hogy a Streptomyces gallinarius DS 25 881 tenyésztésének általános körülményei tág határok között változtathatók, és minden különleges igényhez alkalmazhatók. A 30 504 RP antibiotikumot a fermentléből a következő módon különítjük el: A fermentlét savas pH-nál, általában 3 és 6 közötti, előnyösen 5 körüli pH-nál szűrést elősegítő anyag jelenlétében szűréssel elválasztjuk. A hatóanyag a szűrőlepényben marad vissza, és abból alkalmas szerves oldószer, például kevés szénatomos alkohol, mint amilyen a metanol vagy klórozott szénhidrogén, mint amilyen a metilénklorid, segítségével extrahálással nyerjük ki. A kapott oldatból a nyers terméket úgy különítjük el, hogy az oldatot csökkentett nyomáson kis térfogatra bepároljuk, a bepárlási maradékhoz adott esetben a terméket kevéssé vagy egyáltalán nem oldó oldószert adunk, majd hűtőkamrában állni hagyjuk, mire a termék kikristályosodik. A 30 504 RP antibiotikum szokásos módszerekkel, például átkristáiy6sítással vagy különféle adszorbeáló szereken való kromatografálással vagy ellenáramú megoszlással tisztítható. A következő példa korlátozó jelleg nélkül szemlélteti a találmány gyakorlati végrehajtását. A hőmérsékleti adatokat Celsius-fokban adjuk meg. 1. példa a) Fermentálás 170 literes fermentáló tartályba a következő anyagokat visszük be: pepton 1200 g élesztőkivonat 600 g glükóz-monohidrát 1200 g részlegesen hidrolizált keményítő 2400 g vízvezetéki vízzel kiegészítve 110 literre A keverék pH-ját 50 ml lOn nátriumkarbonát-oldattal 7,3-ra állítjuk be. A folyékony táptalajt 40 percig 122°-os gőz átbuborékoltatásával sterilizáljuk. Mivel a sterilizálás folyamán a gőz részben lecsapódik, a lehűlés után a folyékony táptalaj térfogata 120 liter, és pH-ja 6,9. Keverés közben a táptalajt Erlenmeyer-lombikban tenyésztett Streptomyces gallinarius DS 25 881 200 ml térfogatú szuszpenziójával beoltjuk, és keverés közben 21 óra hosszat steril levegővel levegőztetjük. A tenyészet ekkor alkalmas a termelő tenyésztésre. A termelő tenyésztést 800 literes fermentáló kádban hajtjuk végre. A kádba a következő anyagokat visszük be: szeszmoslék 12,5 kg szacharóz 12,5 kg nátriumklorid 2,5 kg magnéziumszulfát-heptahidrát 1,0 kg kobaltklorid-hexahidrát 20 g/liter koncentrációjú vizes oldata 0,5 liter vízvezetéki vízzel kiegészítve 460 literre A folyékony táptalaj pH-ját 720 ml lOn nátriumkarbonátoldat hozzáadásával 7,5-re állítjuk be, majd 40 percig 122°-os gőz átbuborékoltatásával sterilizáljuk. Mivel a sterilizálás folyamán a gőz részben lecsapódik, a lehűlés után a folyékony táptalaj térfogata 500 liter, és pH-ja 6,40. Ekkor az egészet a fent leírt 170 literes fermentáló edényből vett 50 liter oltóanyaggal beoltjuk, percenként 205 fordulatú turbinával keverés közben és óránként 20 000 liter steril levegővel levegőztetve 27°-on 116 óra hosszat fermentáljuk. A tenyészet pH-jának kezdeti csökkenését 6,5-re korlátozzuk azáltal, hogy önműködő adagolással 5n nátriumkarbonátoldatot adunk hozzá (összesen 0,5 litert használunk fel erre a célra). A művelet végén a fermentlé térfogata 470 liter, és pH-ja 7,85. b) Extrakció A fent leírt körülmények között kapott 1000 liter fermentlét 7 liter 6n sósavval 5 pH-ra megsavanyítjuk, majd fél óra hosszat keverjük. A fermentlét 35 kg szűrést elősegítő anyaggal keverten szűrőprésre visszük, és elválasztjuk. A szűrőlepényt a szűrőn 200 liter olyan vízzel mossuk, amelynek pH-ját 6n sósavval 5-re állítottuk be. A szüredéket és a mosófolyadékot kiontjuk. A szűrőlepényt 700 liter metanolban szuszpendáljuk, és a kapott keverék pH-ját 470 ml 6n nátriumkarbonátoldattal 7-re állítjuk be, majd fél óra hosszat keverjük. A keveréket szűrőprésen szűréssel elválasztjuk, és a szűrőlepényt a szűrőn 100 liter metanollal mossuk. A szüredéket és a mosófolyadékot egyesítjük, és 5—10 Torr nyomáson bepárolva 60 liter vizes koncentrátumot kapunk. A koncentrátum pH-ját 580 ml 6n sósavval 3-ra állítjuk be, majd 40 liter metilénkloridot adunk hozzá, és 10 percig keverjük. A két fázis elválasztása után a vizes fázist előbb 30 liter, majd utána 20 liter metilénkloriddal kétszer extraháljuk. A metilénkloridos kivonatokat egyesítjük, 9 liter vízzel keverjük, és 20 ml 6n sósavval megsavanyítjuk, mire a vizes fázis pH-ja 3 lesz. A szerves fázist elválasztjuk, 18 liter vízzel újra mossuk, majd 20 ml 6n nátriumkarbonát-oldatot hozzáadva a vizes fázis pH-ját 9,5-re 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6